ウーロンテアニン類の生成メカニズムの解明

ウーロンテアニン類は，1988年に橋本らによってウーロン茶から単離・構造決定された，カテキン類である（−）-epicgalloatechin gallate（2：以下EGCg）または（−）-epigallocatechin（1：EGC）が酸化的に二量化した化合物である⁽³⁾3) F. Hashimoto, G. Nonaka & I. Nishioka: Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 36, 1676 (1988).．五員環を含む特徴的な部分構造を有しており，その化学構造が近年，田中らによって訂正されている⁽⁴⁾4) Y. Matsuo, F. Tadakuma, T. Shii, Y. Saito & T. Tanaka: Tetrahedron, 71, 2540 (2015).．同様の構造単位をもつテアシネンシン類がウーロン茶葉5.0 kgから1 g以上得られているのに対し，ウーロンテアニン類は僅か9 mgほどしか得られていない微量成分である（図1図1■カテキン類およびウーロン茶中ポリフェノール2量体の化学構造）．

図1■カテキン類およびウーロン茶中ポリフェノール2量体の化学構造

このような二量体は，ポリフェノールの高分子化における一つの中間体として位置づけることができる．ウーロンテアニン類がカテキンの重合化の際の反応中間体の一つであると仮定すると，その反応機構の解明は高分子ポリフェノールの構造を理解するうえで重要である．そこで筆者らは，ウーロンテアニン類の生成反応について詳細に検討を行ってきたので，紹介する．

カテキン類の化学酸化反応における酸化試薬としては，先に述べたようにさまざまなものが知られている．特に，1964年に滝野らにより紅茶色素テアフラビンの合成が報告されており，K₃Fe（CN）₆/K₂CO₃が用いられている⁽⁵⁾5) Y. Takino, H. Imagawa, H. Horikawa & A. Tanaka: Agric. Biol. Chem., 28, 64 (1964).．しかし，EGCgのみをこの条件で酸化すると，ウーロンテアニンが生成するもののその収率は非常に低く，結合位置が異なる別の二量体が生成した．そのため，ウーロンテアニンの生成量を指標にさまざまな酸化試薬を用いて反応を検討したところ，塩化銅を用いた際に比較的良い収率で得られることが明らかとなった．そこで，EGCgまたはEGCについて，酸化試薬として塩化銅を使用した酸化モデル系を用い，反応の詳細を検討した．その結果，ウーロンテアニンへの反応は1段階ではなく，酸化，加熱，水との反応の3段階を経ていることが判明した．

次に，反応機構を明らかとするために，各段階の中間体，IおよびIIについて構造解析を行った．中間体Iは，MSおよび各種NMRの結果から，dehydrotheasinensin類（6）であると決定した．これは，先述したテアシネンシン類の中間体としても報告されている化合物であり，ウーロンテアニン類とテアシネンシン類は同じ中間体を経て生成することが示された⁽⁶⁾6) T. Shii, M. Miyamoto, Y. Matsuo, T. Tanaka & I. Kouno: Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 59, 1183 (2011).．

中間体IIは，中間体Iであるdehydrotheasinensin類を有機溶剤中で加熱することで得られた．MALDI-TOF-MSを測定したところ，分子イオンピークが中間体Iから－18 Daで検出されたことから，中間体Iのもつヘミアセタール構造が加熱によって脱水し，ケトンへ変換されたものと予想した．¹³C-NMRを測定したところ，予想どおりヘミアセタールの消失が確認された．しかしながら推定構造では分子内にケトンが2つ存在するのにもかかわらず，ケトンに相当するピークは一つしか観察されず，その代わりに160 ppm付近にエステルと推定される新たなシグナルが観察された．

そこで，赤外分光法（FT-IR）を用いた分析を行った．FT-IRは，分子中にどのような種類の結合や官能基が存在するのかを知る手法の一つである．中間体IIは溶解性が悪いこと，水と容易に反応してウーロンテアニンへ変換してしまうことから，粉末試料のまま測定が可能なヌジョール法を用いて測定した．ヌジョール法は粉末試料を流動パラフィン（ヌジョール）に練り込ませて測定する方法である．ヌジョールに由来する吸収も検出されるため，3,000～2,800および1,500～1,300 cm⁻¹の領域の評価ができないことが難点ではあるが，今回のようにカルボニル基付近を観察することは可能である．中間体IおよびIIのFT-IRの分析結果を比較したところ，1,767 cm⁻¹の吸収が新たに見られた．¹³C-NMRの結果と合わせると，中間体IからIIへの反応では，新たにエステル構造が形成されたと考えられ，中間体IIは当初予想していたヘミアセタール部分が脱水した構造ではないことが明らかとなった．

¹³C-NMRからケトン基を一つ有すると推測されたため，構造決定のための誘導化反応としてNaBH₄による還元反応を行った．メタノールに溶解し，約1当量のNaBH₄を加えて室温で反応させた．生成した3つの化合物のうち，主生成物を各種機器分析に供した結果，¹³C-NMRではケトン基を示すシグナルが見られ，ケトン基が還元されていないことが判明した．その代わりに中間体IIに見られていた160 ppm付近のシグナルが消失し，新たにアセタールを示すシグナルが見られた．これらの結果に加え，各種2D-NMRおよび MALDI-TOF-MSの結果から，還元された化合物はエステルが1段階還元されて生成した化合物であると決定された．さらに，この還元体の構造から，中間体IIはラクトン構造を有する化合物であると決定し，pro-oolongtheanin類（7）と命名した（図2図2■ウーロンテアニンの生成メカニズム）．

図2■ウーロンテアニンの生成メカニズム

NaBH₄は弱い還元剤であり，アルデヒドやケトンを還元する反応が一般的によく知られているが，エステルやラクトンの還元には大過剰の試薬または加熱を必要とするとされている^{(7, 8)}7) M. L. Wolfrom & H. B. Wood: J. Am. Chem. Soc., 73, 2933 (1951).8) M. L. Wolfrom & K. Anno: J. Am. Chem. Soc., 74, 5583 (1952).．一方，誘導化反応は約1当量の試薬を用いて室温にて行っており，決して厳しい条件ではない．しかしながら，ケトンが存在するにもかかわらずラクトンが優先的に還元されるという結果であった．NaBH₄によるラクトンの還元反応の例として，中西らによる報告がある．Ginkgolideは，α位に酸素原子をもつラクトン骨格を2つ有する化合物であるが，1当量のNaBH₄を用いて室温で処理したところ，ラクトールが得られたと彼らは報告している⁽⁹⁾9) K. Tanaka, K. D. Kester, N. Berova & K. Nakanishi: Tetrahedron Lett., 46, 531 (2005).．類似した反応条件や構造から，これと同じ現象が中間体IIの還元でも起きたと考えられた．中間体IIはラクトンのα位に水酸基を有する．したがって，NaBH₄がα-水酸基とラクトンのカルボニル基の間で錯体を形成しやすくなり，水素によるラクトンへの求核付加が促進され，ラクトールが生成したと考えられた．このα-水酸基はケトンに対してもα位であるが，このα-水酸基はラクトンのカルボニル基とほぼ同一平面を取っているため，ラクトンのカルボニル基と錯体を形成したものと考えている．

得られたpro-oolongtheanin（7）は，水で処理すると容易にウーロンテアニン類（8）へと変換される．水の代わりにメタノールを用いて反応を行った場合，エステル部分にメタノールが付加して開環し，環を巻き直した化合物（9）が生成することが確認された．これと同じような反応が水でも生じると考えると，中間体IIIが存在すると考えられる（図3図3■中間体IIの誘導化反応）．

図3■中間体IIの誘導化反応

これらの中間体の構造から，ウーロンテアニン類は以下の機構から生成していると推測している⁽¹⁰⁾10) S. Hirose, K. Tomatsu & E. Yanase: Tetrahedron Lett., 54, 7040 (2013).．

• 1）カテキン類の酸化重合による中間体Iの生成．
• 2）加熱による脱水に伴う，分子内転位反応による環の組み換わり（中間体IIの生成）．
• 3）加水分解反応によるラクトン環の開環と再環化．
• 4）脱二酸化炭素および酸化

このようにカテキン類の酸化反応研究において酸化試薬を使用することにより，反応のコントロールが容易となり，また水系以外の溶媒が使用できるため，反応中間体を得ることができた．さらにその結果に基づいて推定メカニズムの提案を行った．しかしながら実際の茶葉中での反応環境とは異なるため，同じような反応が起きているかについてのさらなる研究が必要であると言える．

ウーロンテアニン類の水中における挙動

これまで述べた方法により，ウーロンテアニン類が合成できることが明らかとなった．しかしながら，EGCg由来のoolongtheanin-3′-O-gallate（3）の収率が約40％であるのに対し，EGC由来のdesgalloyloolongtheanin（4）は24％であった．これは，desgalloyl pro-oolongtheanin（7）と水の反応をHPLCで追跡すると，目的物である4以外にもピークが一つ検出され，これが低収率の原因であると予想された．このピークを副生成物と予想してHPLCによる分取を行い，構造解析のために重アセトン溶媒中で各種NMR分析を行ったが，4と全く同じピークが得られた．一方，この化合物を重水に溶解して同様に各種NMR分析を実施したところ，2種類の混合物として観察された．これらのことから，ウーロンテアニン類は水中で平衡混合物として存在する可能性が示された．

図4■水中における平衡反応

先にも述べたようにウーロンテアニン類は近年，田中らによってその化学構造が訂正されており，その際には水素-重水素置換を利用したNMRによる手法が用いられている⁽⁴⁾4) Y. Matsuo, F. Tadakuma, T. Shii, Y. Saito & T. Tanaka: Tetrahedron, 71, 2540 (2015).．¹³C-NMRにおいて，–OH基（水酸基）を有する炭素原子は，–OD基（水酸基のHが重水素Dで置き換わった形）を有する炭素原子とは異なる化学シフトを示す．したがって，重水と重水／軽水で測定した¹³C-NMRデータを比較することで，–OH基が結合している炭素原子を見分けることができる．

この手法を用いて構造解析を行った結果，面白いことに，もともと橋本らによって提唱されていた構造bと田中らによって訂正された構造aが，水中で平衡体として存在することが判明した（図4図4■水中における平衡反応）．このような平衡はメタノールやエタノール中では生じなかった．平衡体の構造では，C-4‴位の水酸基がC-3‴位のケトン基と同一平面上にないためケトン基と水素結合を作らず水酸基がむき出しになるため，極性の高い水中でこのような構造を取るものと考えられた．また，その平衡体の存在比は，ガレート基の有無によって異なることも明らかとなっている⁽¹¹⁾11) S. Hirose, K. Ogawa & E. Yanase: Tetrahedron Lett., 57, 2067 (2016).．

われわれが茶として消費するときには，成分が水中に抽出された状態で摂取するため，実際には平衡体の構造が生理的機能に大きく影響している可能性がある．

カテキン類とウーロンテアニン類の競合酸化反応

前述したウーロンテアニン類がカテキンの高分子化の反応中間体の一つであると仮定するならば，その反応性の解明は発酵茶葉中の高分子ポリフェノールの構造を理解するうえで重要である．そこで，ウーロンテアニン類のさらなる酸化反応を試みた．その結果，予想に反して目立った重合化は見られず，分子内環化反応が生じていることが明らかとなった．

さらに，カテキン-ウーロンテアニン類の複合体の生成を予想し，カテキンとの競合的な酸化反応を試みた．1と4を共存下にて，K₃Fe（CN）₆/K₂CO₃を用いて酸化反応を行ったところ，反応開始直後から1が速やかに減少したのに対し，4の減少はほとんど見られず，1が消失後に4が減少する様子がHPLCにて観察された．新しく生成した化合物はいずれも1同士の酸化物，あるいは4の分子内環化物であり，お互いが反応した化合物は得られなかった．

おわりに

本稿では有機化学的手法を用いた発酵茶高分子ポリフェノールの構造研究の一例として，ウーロンテアニン類の生成機構およびその反応性について紹介した．

高分子ポリフェノール解明の足がかりとして比較的低分子なポリフェノールについて研究を進めることで，その反応中間体を特定することができた．またこの過程でウーロンテアニン類の効率的な合成法が確立できたことから，今後その機能性の研究がさらに進むものと期待している．

一方で，ウーロンテアニン類を高分子ポリフェノールの中間体として捉えた場合，残念ながらその反応性はカテキン類に比べて非常に低いことが判明している．このことから，ウーロン茶高分子ポリフェノールの生成は，ウーロンテアニン類やテアシネンシン類のような2量体がさらに酸化重合して高分子化するのではない可能性があり，これらの低分子ポリフェノールはむしろ安定型な副生成物として高分子化のメインルートからは外れた存在である可能性が示唆された．本稿では触れていないが，カテキン類の1種である（−）-epicatechinの酸化実験を行った場合には，ウーロンテアニン類やテアシネンシン類のようなB環部同士の結合ではなく，A環部の求核性に由来するA–B環間の縮合生成物が主に得られる結果となっている⁽¹²⁾12) K. Uchida, K. Ogawa & E. Yanase: Molecules, 21, 273 (2016).．これらのことから，発酵茶の高分子ポリフェノールの生成は，ウーロンテアニン類のような2量体は経由しておらず，別ルート，たとえばカテキン類のB環部とA環部が関与した酸化重合体である可能性があるのではないかと考えている．

茶に限らず，ポリフェノールは非常に多くの食品に含まれており，それらは一様に機能性が注目されている．しがしながらポリフェノールは酸化反応などの化学的な変化を受けやすく，いまだ化学的に未解明な部分の多い化合物である．今後の高分子ポリフェノールの構造研究では，実際の高分子ポリフェノール側からの構造解析が重要となると予想される．抽出により得られた高分子ポリフェノールの部分構造を直接的に探るための，選択的な加水分解反応の開発も一つの解決策となるだろう．

以上のように，食品に含まれるポリフェノールの解明については，まだ多くの未知なる部分が残されている．今後も，さまざまなアプローチによる，科学的な根拠に基づいた研究の発展が期待される．