はじめに：ブドウ根頭がん腫病とは？

ブドウ根頭がん腫病は，Rhizobium vitis（Ti）（＝Agrobacterium vitis（Ti），A. tumefaciens biovar 3; Tiは植物にがん腫を形成させる能力を有する“根頭がん腫病菌”であることを示す）によって植物の根や茎などにがん腫（がんしゅ）と呼ばれるこぶを形成する土壌病害（図1図1■ブドウ根頭がん腫病の症状）である．本病の被害には樹勢の低下，果実品質の劣化，生育不良，枯死などがあり，特に3年生までの苗木，若木では症状が見られた翌年に枯死することが多い⁽¹⁾1) T. J. Burr, C. Bazzi, S. Süle & L. Otten: Plant Dis., 82, 1288 (1998).．病原細菌は土壌中のブドウ残渣内に少なくとも2年間は生存可能であることから⁽¹⁾1) T. J. Burr, C. Bazzi, S. Süle & L. Otten: Plant Dis., 82, 1288 (1998).，発病樹を改植する際は，できるだけ残渣を取り除くことが求められるが，その完全な除去は不可能である．圃場の大きさや配置などの関係上，改植時に発病樹と同じ場所に定植せざるをえないが，改植場所だけに限定して土壌消毒を行うことは極めて困難である．そのため，新しい苗木を改植しても再び発病してしまう，という悪循環を続けている．

図1■ブドウ根頭がん腫病の症状

本病は世界中のブドウ生産国で問題となっている．特に，海外ではワインの原料としてワイン用のブドウ品種の生産が活発である．わが国における本病による経済的被害の正確な統計はないが，カナダのオンタリオ州では本病の発生によりワイン用ブドウで毎年約200万ドルの経済損失を被っているという統計がある⁽²⁾2) University of Guelph: ScienceDaily, http://www.sciencedaily.com/releases/1999/05/990506153806.htm, 1999.．また，アメリカのバージニア州では2014年に本病が大発生し，今も多くのヴィンヤード（vineyard）やワイナリーで甚大な被害が出ている^{(3, 4)}3) A. Kawaguchi, K. Inoue, K. Tanina & M. Nita: Proc. Jpn. Acad. B, 93, 547 (2017).4) M. Nita: Grape Press, Virginia Vineyards Association, Waterford, VA, 2014.．近年は日本においても，東日本を中心として本病の発生および被害が再び増加してきており，大きな問題である．

これまで，植物根頭がん腫病の病原細菌として複数種が報告されており，そのうちR. radiobacter（Ti）（＝A. tumefaciens（Ti），A. tumefaciens biovar 1）とR. rhizogenes（Ti）（＝A. rhizogenes（Ti），A. tumefaciens biovar 2）の宿主範囲が非常に広く，93科643種以上の双子葉植物に寄生性があるとされている⁽⁵⁾5) 後藤正夫：“植物細菌病学概論”，養賢堂，1990, p. 128.．世界中で発生しているが，卓効を示す化学農薬はない．生物防除技術の開発は古くから取り組まれており，オーストラリアのモモ園の土壌から分離・同定された非病原性R. rhizogenes（＝A. radiobacter biovar 2）K84株によるバラ根頭がん腫病の生物防除は世界的に有名である⁽⁶⁾6) A. Kerr: Plant Dis., 64, 25 (1980).．日本でもその防除効果が実証されており⁽⁷⁾7) 牧野孝宏：植物防疫，40, 540 (1986) .，微生物農薬アグロバクテリウム・ラジオバクター剤として市販されている．しかし，R. vitis（Ti）はK84株が産生する抗菌物質であるアグロシン84に対して耐性をもつため，K84株はブドウ根頭がん腫病には防除効果がない^{(3, 8～10)}3) A. Kawaguchi, K. Inoue, K. Tanina & M. Nita: Proc. Jpn. Acad. B, 93, 547 (2017).8) A. Kawaguchi, K. Inoue & H. Nasu: J. Gen. Plant Pathol., 71, 422 (2005).9) A. Kawaguchi, K. Inoue & H. Nasu: J. Gen. Plant Pathol., 73, 133 (2007).10) A. Kawaguchi, K. Inoue & Y. Ichinose: Phytopathology, 98, 1218 (2008).．これまで世界中の研究者がブドウ根頭がん腫病に対する拮抗細菌の探索を行ってきたが，いまだに実用化された菌株は存在しない^(11～14)11) T. J. Burr & C. L. Reid: Am. J. Enol. Vitic., 45, 21 (1994).12) T. J. Burr & L. Otten: Annu. Rev. Phytopathol., 37, 53 (1999).13) T. J. Burr, C. L. Reid, E. Taglicti, C. Bazzi & S. Süle: Phytopathology, 87, 706 (1997).14) F. Chen, Y. B. Guo, J. H. Wang, J. Y. Li & H. M. Wang: Plant Dis., 91, 957 (2007).．以上のことから，ブドウ生産現場では本病を防ぐ有効な手段がないのが現状である．

発病を抑制する新規拮抗細菌の発見

筆者らはブドウ苗木を生産するための母樹および商品として流通しているブドウ苗木について本病の診断を行ったところ，それらのサンプルからがん腫形成能を欠く非病原性R. vitisの菌株が複数分離された．これらの菌株のうち，病原性菌と混合しても検定植物であるトマト苗の茎に接種したがん腫形成が起こらないものが見つかった．このことから，非病原性R. vitisの菌株の中にはがん腫形成抑制効果を有する菌株が存在する可能性が示唆された．そこで，分離された非病原性菌306菌株について生物防除に有望な菌株の選抜を行った．すなわち，R. vitis（Ti）と非病原性R. vitisの各菌株をそれぞれ等量で混合し（混合比率1:1，菌濃度10⁸ cells/mL），播種1カ月後のトマト苗およびブドウ1年生実生苗の茎に単刺有傷接種してがん腫形成の有無および程度を調べた（以下，等量混合接種試験とする）．その結果，発病抑制効果の高いARK-1株を選抜した（図2図2■ブドウ実生苗を用いたブドウ根頭がん腫病菌と非病原性菌の混合接種）．

図2■ブドウ実生苗を用いたブドウ根頭がん腫病菌と非病原性菌の混合接種

病原細菌のみを接種したブドウ苗（A）および病原細菌とARK-1株を等量混合して接種したブドウ苗（B）．白い矢印は形成されたがん腫を示す．

本来，拮抗微生物を用いた植物病害の生物防除では，拮抗微生物を予防的に植物に接種，定着させるのは勿論のこと，自然界で想定される病原菌の密度よりも10～100倍以上高い濃度で処理することが多い．今回の選抜試験では，病原菌と同濃度，等量でかつ同時に植物に接種するという非常に厳しい条件で行ったにもかかわらず，安定的な発病抑制効果をもつ菌株が選抜されたことは，その後の防除試験においても高い効果が期待できると考えられた．

また，R. vitis（Ti）は必須遺伝子の塩基配列の違いから，少なくとも5つ（A～E）の遺伝子型（Genotype）に類別され，日本には主にAおよびBグループの菌が広く分布している^{(15, 16)}15) A. Kawaguchi, H. Sawada & Y. Ichinose: Plant Pathol., 57, 747 (2008).16) A. Kawaguchi: J. Gen. Plant Pathol., 77, 299 (2011).．このため，それぞれの遺伝子型に属する代表的なR. vitis（Ti）5菌株を用いて混合菌液を作成し，前述のブドウ実生苗による等量混合接種試験を行った．その結果ARK-1株はやはりがん腫形成を強く抑制したことから，ARK-1株は現在知られているR. vitis（Ti）の主要な系統の菌株に対して効果があることが示唆された．

圃場における防除効果

拮抗微生物の効果に関する実験室レベルでの報告はこれまででも非常に多いが，圃場レベルでの安定的な効果となると報告数は少ない．その中から生物農薬となって市販されるものはさらに少ないのが現状である．筆者は圃場での防除効果について，複数の実験圃場で防除効果を検討した．処理方法は苗木の根をARK-1菌液（約10⁸ cells/mL）に1時間ほど浸漬する方法で行った．浸漬処理の後，4月頃に圃場に定植し，約10～12カ月後に掘り起こしてがん腫形成の有無を調査した．試験は2009～2013年に合計9回に分けて実施した．得られたデータはメタアナリシスによって評価した．その結果，ARK-1株処理区で高い防除効果が認められた（図3図3■ブドウ根頭がん腫病に対する防除効果（圃場試験），統合リスク比0.18）．また，本試験以外にほかの研究機関で実施されたARK-1株の圃場試験でも安定した防除効果を示したことから，R. vitis（Ti）が感染していない健全なブドウ苗木に対してARK-1株を定植前に処理することによって本病害を予防できることが明らかとなり，今日まで防除が困難であった本病の生物防除技術を確立するための基礎が築けたものと考えられた．

図3■ブドウ根頭がん腫病に対する防除効果（圃場試験）

それぞれ独立して実施した防除試験9事例を変量効果モデル統合方法であるDerSimonian–Laird methodで解析し，ARK-1株処理区と無処理区の発病割合の比をリスク比とした．無処理区に対する統合リスク比は0.18（p＜0.001）．

さらにARK-1株は，ブドウに発生する根頭がんしゅ病だけでなく，リンゴ，モモ，ナシなどの根頭がんしゅ病に対しても高い防除効果を示すことを圃場試験で確認していることから，ブドウだけに限らず，さまざまな植物への応用も期待される⁽¹⁷⁾17) A. Kawaguchi, K. Inoue & K. Tanina: Plant Dis., 99, 409 (2015).．

ブドウ根部での定着性

拮抗微生物が高い防除効果を持続的に発揮させるためには，処理した植物や環境に親和性を有し，効果を発揮するために必要な菌数を保持したまま定着することが求められる．特に，果樹のような永年性作物の場合は防除効果の持続性が重要となることから，ブドウの根におけるARK-1株の定着性について検討した．ブドウ2年生苗（穂木：ピオーネ，台木：テレキ5BB）の根部をARK-1sc株（ストレプトマイシンと硫酸銅に対する耐性を獲得させたARK-1変異株）の菌液（2×10⁸ cells/mL）に1時間浸漬処理した後，ポットに定植して温室で管理し，定期的に掘り取って根部に接種されたARK-1sc株の菌数を希釈平板法で検出した．その結果，根の表面から分離される菌は接種24カ月後にはほぼ検出限界まで低下したのに対し，根の内部から分離される菌は接種18カ月まで緩やかに菌数が低下し，24カ月後でも約10⁵ CFU/g根の菌数が検出された（図4図4■ARK-1株のブドウ根部に対する定着性）．ARK-1は根の内部で長期間生存できると考えられ，一種の内生細菌である可能性が示唆された．

図4■ARK-1株のブドウ根部に対する定着性

バーは標準誤差を示す．

ユニークな拮抗作用機構の解明に迫る

ARK-1株の拮抗作用機構についてはまだ不明な点が多いものの，一部興味深いメカニズムが明らかになってきている．ARK-1株をオートクレーブで滅菌した菌液（菌体，培養物含む）や，液体培養後の上清（フィルター濾過して菌体を除去したもの）では，ブドウへの等量混合接種において全く防除効果が認められなかった⁽¹⁸⁾18) A. Kawaguchi & K. Inoue: J. Phytopathol., 160, 509 (2012).．このことから，防除にはARK-1株の生きた菌体そのものが必要であると考えられた．また，ARK-1株とR. vitis（Ti）をブドウに等量混合接種すると，接種部位において，接種1～5日後までは両菌株とも同じように増殖するが，その後R. vitis（Ti）の菌数はARK-1株の1/10程度に減少していくことが明らかになった⁽¹⁹⁾19) A. Kawaguchi: Microbes Environ., 29, 296 (2014).．

このように，ARK-1株はブドウ体内でR. vitis（Ti）を完全に死滅させないにもかかわらず，非常に高い防除効果を発揮するという現象から，ARK-1株はこれまで知られているような抗菌物質による病原菌の抗菌／静菌作用とは異なる，新しい拮抗作用機構を有するのではないかと考えた．そこで，「ARK-1株はR. vitis（Ti）の病原性の発現を抑制する」という仮説を立てた．

ARK-1株とR. vitis（Ti）をブドウ実生苗の主幹部に等量混合接種した際の接種部位におけるR. vitis（Ti）の病原性関連遺伝子群（vir領域）の発現量を測定した．接種部位のブドウ主幹部の組織から抽出した全RNAを鋳型とし，RT-qPCRによってvir領域内のvirD2とvirE2の発現量を定量した結果，ARK-1株を混合した接種部位の発現量は，R. vitis（Ti）単独接種における発現量の1/3～1/7まで低下していた（図5図5■ブドウ体内における根頭がん腫病菌の病原関連遺伝子の発現（接種1日後）, Kawaguchi, 2015）．対照として，拮抗能力を有しない非病原性R. vitis VAR06-30株でも同じ試験を行ったが，こちらはvirD2とvirE2の発現量を低下させることはなかった⁽²⁰⁾20) A. Kawaguchi: Eur. J. Plant Pathol., 142, 789 (2015).（図5図5■ブドウ体内における根頭がん腫病菌の病原関連遺伝子の発現（接種1日後））．

図5■ブドウ体内における根頭がん腫病菌の病原関連遺伝子の発現（接種1日後）

ブドウ根頭がん腫病菌（R. vitis（Ti））の単独接種時の発現量を100％とした相対比較．VAR06-30株は拮抗能力を有しない非病原性R. vitis．エラーバーは標準偏差．異なる英文字間には有意差（p＜0.05）あり（Tukey HSD test）．

以上より，ARK-1株の拮抗作用機構には，短期的にはR. vitis（Ti）のvir領域の発現抑制が，長期的にはR. vitis（Ti）の増殖抑制が関与すると考えられた．われわれはこれまでの研究データから，ARK-1株によるR. vitis（Ti）のvir領域の発現抑制効果により，腫瘍形成遺伝子であるT-DNAの植物体への取り込みが阻害され，植物細胞ががん腫形成に至らないのでないかと推察している（図6図6■ARK-1株による防除メカニズム（研究データに基づく仮説））．

図6■ARK-1株による防除メカニズム（研究データに基づく仮説）

（A）一般的なブドウ根頭がん腫病の発病メカニズム（B）ARK-1株存在下における，根頭がん腫病菌のvir領域遺伝子群の発現抑制

このように，ARK-1株の拮抗作用機構について一定の知見を得ることができたが，ARK-1株による植物の病害抵抗性誘導や，ほかのvir領域の発現への影響，それらの性能に関係する新規遺伝子の存在など，まだまだ不明な点が多い．今後もさまざまな観点から研究を進めて行き，防除作用機構の解明を目指したい．

おわりに

ブドウは生食用，ワインなどの醸造用として非常に重要な品目であるため，本病に対する防除のニーズは世界中にある．世界的には特に醸造用のニーズが高く，世界中のワイン産業で本病の防除対策が切望されている．

世界における本病の生物防除研究について見てみると，本研究のようにブドウ主幹部を用いた接種試験でがん腫形成抑制効果が認められた拮抗細菌として非病原性R. vitis F2/5株^{(11, 13)}11) T. J. Burr & C. L. Reid: Am. J. Enol. Vitic., 45, 21 (1994).13) T. J. Burr, C. L. Reid, E. Taglicti, C. Bazzi & S. Süle: Phytopathology, 87, 706 (1997).と非病原性R. vitis E26株⁽¹⁴⁾14) F. Chen, Y. B. Guo, J. H. Wang, J. Y. Li & H. M. Wang: Plant Dis., 91, 957 (2007).がある．しかし，いずれも圃場試験で安定した効果を示したという報告はないことから，われわれのARK-1株が世界で最も実用化に近い位置に立っており，本研究分野で先駆的な役割を果たしている．

本菌株は健全な苗木に予防的に処理し，発生圃場において処理した苗木が新たに発病することを予防する，ということを目的とすべきである．つまり，R. vitis（Ti）は植物細胞を形質転換させて腫瘍化させるという発病機構であるため，形質転換が完了した細胞に対しては拮抗微生物を投与しても治療効果は期待できない．しかしながら，世界中のブドウ産地では今も膨大な数のブドウが生育しており，発病樹，感染しているがまだ発病していない未発病樹（感染樹），健全樹（未感染樹）の3種類が一つのブドウ園内に混在している．すでに定植されている未発病樹や健全樹に対してARK-1株をいかに処理していくか，または，発病樹に処理することで延命効果が期待できるかについて，今後検討していく必要がある．

土壌病害には効果のある化学農薬が少なく，土壌消毒には高い導入コストを必要とする場合が多い．その点からも，生物防除は土壌病害に対する有効な手段として期待され続ける存在だと言える．筆者らが取り組んでいる本研究が，ブドウ根頭がん腫病に対する世界初の有効な防除技術として，農業生産者が実施可能な形にするために，今後も実用化に向けた活動を継続していきたい．