海藻多糖分解酵素の利用

1. アガラーゼ

アガロース（寒天）は，テングサやオゴノリなどの紅藻類の細胞壁成分であり，D-ガラクトースと3,6-アンヒドロ-L-ガラクトースがα-1,3, β-1,4結合で交互につながったヘテロ多糖であり，多くの微生物にとっては難分解有機物の一つである．アガロースをオリゴ糖サイズにまで切断して得られる「寒天オリゴ糖」には，さまざまな優れた生理的機能があることが報告されている⁽⁴⁾4) 有賀　修，岡本直樹，井上貴由，久保　元，森山浩憲：応用糖質科学，2, 142 (2012).ことから，われわれはアガロース切断酵素（アガラーゼ）を深海由来細菌より探索した．その結果，アガロースのα-1,3結合を切断してアガロオリゴ糖を生産する酵素「α-アガラーゼ」，β-1,4結合を切断して，ネオアガロオリゴ2, 4, 6糖をそれぞれ生成する複数の「β-アガラーゼ」を取得した．そのうちの一つ，Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94^T株に由来するβ-アガラーゼはとりわけ高い耐熱性をもっていた⁽⁵⁾5) Y. Ohta, Y. Nogi, M. Miyazaki, Z. Li, Y. Hatada, S. Ito & K. Horikoshi: Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 1073 (2004).．現在，本酵素は遺伝子試薬メーカーから遺伝子研究用試薬として販売されている．本アガラーゼは，アガロースゲル電気泳動で分離したDNA断片の回収に利用することができる．あらかじめ加温溶解したゲルにアガラーゼを混ぜるだけという簡便な操作で，ゲルは不可逆的に可溶化される．特に高分子DNAを損傷することなく効率良く回収ができる点（160 kbまで確認済み），実験操作で発生するプラスチックごみを最小限に抑えられる点，有毒試薬を使用しない点で，従前の使い捨ての精製カラムと変性剤を併用する手法よりも優れている．回収したDNA断片は，そのまま次の実験に用いることができることから，さまざまな研究機関における遺伝子機能解析・配列解析に活用いただいている（図1図1■アガラーゼを用いたアガロースゲルからのDNA断片の回収とその利用）．

図1■アガラーゼを用いたアガロースゲルからのDNA断片の回収とその利用

リグニン分解酵素の利用

陸域の植物には主要成分としてリグニンが含まれており，その構造的特性から生物分解が著しく困難な物質と位置づけられる．セルロースに次ぐ第2位の存在量をもち，地球最大の再生可能な芳香族化合物資源であるとされる．再生可能資源である植物バイオマスを利用しようとするとき，それらのすべての成分を無駄なく利用することが重要である．リグニンは構造が複雑であるため，さまざまな化学品などの有価物に変換できる可能性をもっている．しかしその反面，構造の正確な理解や制御が困難であり，さらに生成物の分離精製にも大きなコストがかかるという難点をもっている．これらを克服するため，植物のリグニンを遺伝子操作によって改変して利用効率を上げる試みや，さまざまな触媒を使った化学的・生物学的手法が開発されている⁽⁹⁾9) A. J. Ragauskas, G. T. Beckham, M. J. Biddy, R. Chandra, F. Chen, M. F. Davis, B. H. Davison, R. A. Dixon, P. Gilna, M. Keller et al.: Science, 344, 1246843 (2014).．

われわれは，海洋微生物の酵素群を使ったリグニンを原料とする芳香族化合物の生産を実現するため，まず海域からリグニン関連芳香族代謝細菌の分離を試みた．分離源として，駿河湾海底から回収された沈木を選び（図2図2■穿孔性二枚貝による侵食が進んだ海底沈木），種々のオガクズを人工海水に混ぜ，海底の沈木を模した培地を用いて，本沈木に生息する微生物を培養した⁽¹⁰⁾10) Y. Ohta, S. Nishi, T. Haga, T. Tsubouchi, R. Hasegawa, M. Konishi, Y. Nagano, Y. Tsuruwaka, Y. Shimane, K. Mori et al.: Open J. Mar. Sci., 2, 177 (2012).．また，沖縄県南西諸島海溝に沈設，約1年半後に無人探査機「かいこう7000II」で回収された木材，加えて東北沖深度約5,000 mに生息するシロウリガイコロニー付近から「しんかい6500」を使って採取された底泥（図3図3■「しんかい6500」を使った深海底泥の採取）からも，同様にリグニン関連芳香族代謝微生物の分離を試みた．ここで単離した細菌に対し，p-クマル酸（p-coumaric acid），フェルラ酸（ferulic acid）などのリグニンに関連する芳香族モノマーを基質として，これらを代謝する能力の有無を調べたところ，被検菌株のうちの約4割の株に代謝活性が検出された．これらの微生物の分類学的位置を，16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列に基づき調べたところ，それらのすべてがデータベースに登録された基準株の配列とは異なっており（97～99％の一致性），各分離株は相互に異なる16SリボソームRNA遺伝子配列をもつ微生物であることがわかった．海域から分離される微生物は陸域で検出される微生物と共通するものも多く存在するが，海洋固有種と位置づけられる微生物も存在した．

図2■穿孔性二枚貝による侵食が進んだ海底沈木

図3■「しんかい6500」を使った深海底泥の採取

単離微生物のうち，Bacillus属細菌の代謝物をガスクロマトグラフィーで調べたところ，p-クマル酸・フェルラ酸などのフェノール酸からの脱炭酸反応を触媒しており，両化合物に由来するヒドロキシスチレン誘導体を生成していることがわかった．ヒドロキシスチレン誘導体はバイオベースプラスチックの原料としても期待される．

南西諸島海溝に人工的に沈設した木材からは，Sulfitobacter属細菌やShewanella属細菌などが分離された．Sulfitobacter属細菌はα-プロテオバクテリア門に属する海洋性細菌であり，海洋の炭素や硫黄循環に重要な役割を担う菌，海洋石油汚染域に高頻度で出現する菌としても知られている．上記探索で単離したSulfitobacter属細菌のドラフトゲノム解析を行ったところ，細菌による芳香族化合物代謝の鍵化合物とされるプロトカテク酸（protocatechuic acid）の芳香環開裂とその下流代謝の遺伝子クラスターを検出した．

Shewanella属細菌はγ-プロテオバクテリア門に属する海洋性細菌であり，細胞膜シトクロームを介して細胞外に電子を出す機能があることで注目されており，発電菌や重金属還元菌，あるいは環境汚染物質（アゾ色素や多環芳香族など）の分解菌として，それらの代謝機構解明や利活用を目指した精力的な研究が行われている．多くの細菌がリグニンに由来する芳香族化合物を酸化的に分解することが多いのに対し，Shewanella属分離株は1分子のフェルラ酸に2つの水素原子を添加する還元代謝を有していた．

Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium, Sphingopyxis属細菌などから形成される“スフィンゴモナド”と呼ばれる細菌群は，芳香環を含む難分解性公害物質分解菌として注目されてきた⁽¹¹⁾11) A. Stolz: Appl. Microbiol. Biotechnol., 81, 793 (2009).．上記探索の過程で単離したNovosphingobium MBES04株は，多様な芳香族モノマー代謝能をもつにとどまらず，guaiacylglycerol-β-guaiacyl etherなどのリグニンモデルダイマー中のβ-O-4結合を開裂し，モノマーへ変換する能力を有していた（図4図4■Novosphingobium単離株によるリグニンモデルダイマーのモノマーへの変換）．β-O-4結合はリグニンを構成するモノマー間の最主要結合であり，リグニン変換の重要なターゲットである．MBES04株のゲノムにコードされる遺伝子配列を利用して，β-O-4結合開裂酵素5種を組換え生産し，これらの酵素をワンポットでスギやユーカリから抽出したミルドウッドリグニン（MWL）に作用させることにより，MWLからフェニルプロパン構造を有する芳香族モノマーを生産することに成功した^{(12, 13)}12) Y. Ohta, S. Nishi, R. Hasegawa & Y. Hatada: Sci. Rep., 5, 15105 (2015).13) Y. Ohta, R. Hasegawa, K. Kurosawa, A. Maeda, T. Koizumi, H. Nishimura, H. Okada, C. Qu, K. Saito, T. Watanabe et al.: ChemSusChem, 10, 425 (2017).（図5図5■ミルドウッドリグニンからの芳香族モノマーの生産）．

図4■Novosphingobium単離株によるリグニンモデルダイマーのモノマーへの変換

図5■ミルドウッドリグニンからの芳香族モノマーの生産

フェニルプロパン系化合物は，工業分野においては，香水，香料，精油，殺菌剤，麻酔薬，抗酸化剤などの医薬品や機能性食品およびそれらの合成中間体となる有用な化合物群である．そこでわれわれは上記芳香族モノマーを基幹低分子化合物としてリグニンの有効利用に寄与する可能性を探るために，前述の酵素反応で生産可能な芳香族モノマーの1種であるguaiacylhydroxypropanone（GHP）から誘導可能な化合物の合成について検討を行った（図6図6■芳香族モノマー（GHP: グアヤシルヒドロキシプロパノン）からバイオプラスチックへの展開）．これまでに，新規な各種ポリマー，たとえば，エポキシ樹脂，ポリカーボネート樹脂，アクリレート樹脂，ポリウレタン，アリール系オリゴマー，レジストなどの光感受性組成物の製造原料として有望な化合物への誘導化にも成功した．

図6■芳香族モノマー（GHP: グアヤシルヒドロキシプロパノン）からバイオプラスチックへの展開

現在，木材から環境調和型プロセスを経て芳香族モノマーを生産し，さらに新素材「スーパーウルシ」へとつなげるという新しいリグニン有効利用技術の確立に向けて，さらなる研究を展開している．

海底下微生物を使ったバイオマス変換

大陸沿岸域の有機物に富む堆積物に生息する膨大な数の嫌気性微生物群集の代謝活動は，地質学的な時間をかけ，地球表層と内部をつなぐ元素循環に重要な役割を果たしている．しかし，その個々の微生物の生理・代謝機能やゲノム進化，生態系が地球環境に果たしてきた役割などについては，いまだ未解明の部分が多い．

地球深部探査船「ちきゅう」を用いた国際深海掘削計画（International Ocean Discovery Program）第337次研究航海「下北八戸沖石炭層生命圏掘削調査」の成果によって，海底下深部に埋没した未熟性の石炭（褐炭）層から，嫌気バイオリアクターを用いて集積培養されたメタン生成を伴う微生物群集は，最終的に余分な栄養源を加えることなく，石炭層に嫌気水を添加するだけで，微生物の増殖とメタン生成することが確認されている⁽¹⁴⁾14) H. Imachi, K. Aoi, E. Tasumi, Y. Saito, Y. Yamanaka, Y. Saito, T. Yamaguchi, H. Tomaru, R. Takeuchi, Y. Morono et al.: ISME J., 5, 1751 (2011).．

地球最強のリグニン分解生物と考えられている白色腐朽菌は生育やリグニン分解に酸素を必須としており，嫌気環境ではそのいずれも行うことができない．嫌気環境でのリグニンの分解速度は著しく遅いとされ，これまで研究の対象とされることはほとんどなかった．しかし一部の先駆的な研究においては，海底下微生物群集が，リグニン由来芳香族モノマーのメトキシ基を炭素源として，酢酸を生成する可能性や土壌微生物群集が芳香族モノマーを原料として，酢酸を中間体とするメタン生成代謝ネットワークを有すること⁽¹⁵⁾15) M. A. Lever, B. Verena, Y. Heuer, Y. Morono, N. Masui, F. Schmidt, M. J. Alperin, F. Inagaki, K. U. Hinrichs & A. Teske: Geomicrobiol. J., 27, 183 (2010).などが議論されている．酢酸生成微生物のマーカー酵素として，ホルミルテトラ葉酸合成酵素が挙げられる．興味深いことに，好気性のα-プロテオバクテリウム門に属するSphingomonas属細菌が行う芳香族モノマーメトキシ基からの脱メチル反応には，同酵素が関与することが報告されている⁽¹⁶⁾16) T. Abe, E. Masai, K. Miyauchi, Y. Katayama & M. Fukuda: J. Bacteriol., 187, 2030 (2005).．さらに，そのほかの硫酸還元能やメチル基資化能をもつα, β, δ-プロテオバクテリア門細菌の保有する一部の酵素においても，酢酸生成アーキアのもつ同酵素群との高い類似性が見いだされている⁽¹⁷⁾17) M. A. Lever: FEMS Microbiol. Ecol., 84, 1 (2013).．

われわれは最近，上述の嫌気バイオリアクター集積微生物群集を用いて，好気から嫌気環境へ変化する条件の下，リグニンモデル2量体化合物メトキシ基からの非常に迅速な脱メチル化が起きることを観察した．また近年われわれが深海沈木から単離した，リグニン主要結合を還元開裂するMBES04株は好気条件で生育するものの，リグニン主要結合の開裂においては還元型グルタチオンを水素供給源とする還元開裂を行う．本開裂反応は正味の物質の出入りを伴わない点で，酸素添加を基本とするリグニンパーオキシダーゼなどによる酸化的リグニン変換とは異なっている．

組換えタンパク質高生産系の開発

われわれは酵素の探索・開発と並行して，酵素利用に重要な技術としてBacillus属細菌を宿主とする組換えタンパク質高生産システムの開発を行ってきた．プラスミドに挿入した目的遺伝子の発現調節には極限環境や海域から分離した細菌のゲノム配列の一部を活用した．目的遺伝子の上流にBacillus sp. strain JAMB-750のマンナナーゼ遺伝子のプロモーター配列，下流にThalassomoas sp. strain A33のアガラーゼ遺伝子のターミネータ配列を配置し，これにランダムな変異を多重に加えていくことで，効率的な組換えタンパク分泌生産を実現することができた⁽¹⁸⁾18) 秦田勇二，大田ゆかり，日高祐子，中村信之，特許第5126879号，新規DNA断片およびそれを含む組換えベクター，それらによって形質転換された形質転換体，ならびにそれらの利用．通常組換えタンパク生産には，プラスミド上の目的遺伝子を安定に保持するために，同プラスミドに抗生物質耐性遺伝子を連結し，微生物培養培地には抗生物質を添加する．この方法を大規模に産業利用する場合には，抗生物質や抗生物質耐性遺伝子の環境への拡散を厳重に防ぐ設備が必須となり，大きな生産コスト増となる．そこで，われわれは生育必須遺伝子の一つとして，宿主自身がもつトリプトファニルt-RNA合成遺伝子をプラスミド上に配置し，同遺伝子を宿主染色体から欠損させた宿主ベクター系を新たに開発した．この系では培地中に抗生物質添加は不要であり，栄養を制限することなく，安価な培地で高密度培養と組換えタンパク質の高生産が可能であった．

おわりに

難分解性有機物を分解する酵素をはじめとする優れた生物機能は，海域や海底下を含めた地球の至る所に存在する．全地球には未培養の多くの微生物が存在する．さらに単離した菌株を育種するさまざまな手法は目覚ましい速度で進展している．今後の微生物機能の探索・開発にさらなる大きな発展を期待したい．