印旛沼について

本稿の調査の舞台は，千葉県北部に位置する印旛沼である．印旛沼は，かつては内海の一部であったが，河川による土砂の堆積などにより湖沼化が進んだと考えられている．江戸時代に入り，治水のために利根川の流れを変える大規模な工事が行われたことで，利根川の氾濫水が印旛沼へ流れ込むようになり，たびたび洪水の被害を受けることとなった．戦後，食糧難と失業対策のため策定された「緊急干拓事業」の一環として印旛沼の干拓が計画され，その後紆余曲折を経て昭和44年にようやく竣工した．これにより，西印旛沼・北印旛沼と，それらをつなぐ水路という，現在の姿となった（図1図1■（A）舟戸大橋から見た西印旛沼（筆者撮影）．カミツキガメは岸近くの水深の浅いところや，水田の用水路，支流の川底などに生息している．本稿で使用した試料は，この写真の左手のほう，師戸干拓付近で夏から秋にかけて採取したものである．（B）現在の印旛沼は，戦後の埋め立てによって西印旛沼と北印旛沼に分断され，間を水路がつなぐ形状となった．赤で囲んだ部分は，採水を行った西印旛沼の徹底的排除区．）．

図1■（A）舟戸大橋から見た西印旛沼（筆者撮影）．カミツキガメは岸近くの水深の浅いところや，水田の用水路，支流の川底などに生息している．本稿で使用した試料は，この写真の左手のほう，師戸干拓付近で夏から秋にかけて採取したものである．（B）現在の印旛沼は，戦後の埋め立てによって西印旛沼と北印旛沼に分断され，間を水路がつなぐ形状となった．赤で囲んだ部分は，採水を行った西印旛沼の徹底的排除区．

干拓前の印旛沼には，多種多様な魚介類が生息し，沼在来の魚類，甲殻類や貝類のほか，利根川を遡上してきた魚や，他所から人為的に移入してきた魚など，非常に多くの種が生息していた．干拓後の沼は，環境変化によって生息種の変化が起こり，加えて，海外からの外来種も繁殖，定着が進んでいる．このようなさまざまな生物種は，漁獲調査によって記録されているが，今回の環境DNA分析によっても現在の生息種の状況が検出されており，外来種対策とは別に，印旛沼の魚類相の変遷を効率良く調査する手段としても環境DNA分析が利用できそうである．

なお，印旛沼の歴史的な変遷や現状については，詳しくはたとえば印旛沼環境基金の報告⁽¹⁾1) 公益財団法人印旛沼環境基金編：“平成27・28年版　いんば沼白書”，公益財団法人印旛沼環境基金，2016.などを参照されたい．

外来種問題と印旛沼のカミツキガメ

さて，近年，日本国内のさまざまな地域で，外来種の侵入と定着が問題となっている．このところ頻繁に（センセーショナルに）報道やテレビ番組などで採り上げられることもあり，外来種問題は一般にも比較的関心の高いニュースのようである．外来種とは，一般的には，その地域に元々いなかった生物種が，人間活動に伴って（故意もしくは偶発的に）他地域から移入され，そこに定着，繁殖したものとされている．こういう生物種のなかには，在来の生物種（在来種）と干渉せずに棲み分けるものもいるが，多くは在来種と生息空間やえさなどを競合し，あるいは在来種をえさとして捕食するなど，強く干渉して在来種の存続を脅かすものも少なくない．

そこで国は2005年，「特定外来生物による生態系等に係る被害の防止に関する法律」（以下，外来生物法）を策定し，環境省の管轄の元，規制を行っている．外来生物法では，生態系，人の生命・身体，農林水産業に被害を及ぼす，あるいは及ぼすおそれのある外来種を「特定外来生物」として指定し，防除の対象とする，印旛沼においてもさまざまな外来種がすでに定着していることがわかっており，生態系に少なからぬ影響を与えている．本稿で採り上げるカミツキガメもまた，そのような特定外来生物の一種である．

カミツキガメが印旛沼水系に定着した経緯については，詳細は不明なようであるが，おそらくペットの飼育放棄などで放逐された個体が定着，繁殖したものと考えられている．1978年の発見が最初とされ，1990年代後半以降，頻繁に目撃されるようになった．外来生物法により，2005年にカミツキガメが特定外来生物に指定されたことから，対策を行う主体である千葉県は，2007年に防除実施計画を策定し，本格的に防除事業を開始した．しかし，捕獲頭数は増加しつづけ，2015年に行った生息数の推定調査では，約16,000頭が生息しているとされた．増減予測の結果，今後，個体数を減少させるには，年間1,250頭以上のメスを捕獲することが必要とされた．こういった推定結果と，それまでの実績を踏まえ，千葉県では，防除方法や体制を全面的に見直し，2017年に防除計画の改定を行って，対策強化に乗り出している⁽²⁾2) 千葉県：“千葉県に於けるカミツキガメ防除実施計画書”，千葉県，2007年策定，2017年改定．．なお，印旛沼は，全国的に見ると突出してカミツキガメ生息数が多く，生息密度も非常に高い．一方，現状では，他地域でのカミツキガメ発見事例は単発のケースがほとんどのようである．

環境DNA分析によるカミツキガメの検出

現在の防除事業では，カミツキガメ捕獲結果などを元に分布状況を推定している．しかし，分布密度の低い地域では捕獲や発見の頻度も低下するため，在不在の確認が難しくなる．また，防除が進んで根絶に近づいた場合，そのような分布密度の低い状況での調査となるため，在不在状況のモニタリングが困難となり，さらには根絶確認の方法も問題となる．ここでもし，沼の水に含まれる環境DNAを分析することによりカミツキガメを検出できれば，カミツキガメを捕獲せずとも，水を調べることで在不在の確認ができるはずである．また，基本的に採水のみで捕獲を伴わないことから，広範囲にわたっての調査も比較的容易となる．そこで，環境DNAによるカミツキガメのモニタリングが可能かについての検討を進めることとした．

環境DNAとは，生物が環境中に放出した粘液や組織片，糞などに含まれるDNAのことで，これを採取，分析することで，採取した場所にいた生物種やその数などを推定できる⁽³⁾3) G. F. Ficetola, C. Miaud, F. Pompanon & P. Taberlet: Biol. Lett., 4, 423 (2008).．われわれはまず，西印旛沼の徹底的排除区⁽²⁾2) 千葉県：“千葉県に於けるカミツキガメ防除実施計画書”，千葉県，2007年策定，2017年改定．から水を採取し，環境DNAの抽出を試みた．ここでは，今後多数の試料を処理していくであろうことを念頭に，特別な装備の要らない簡便さにこだわって，宮らの開発したステリベクスフィルターによる採取法⁽⁴⁾4) M. Miya, T. Minamoto, H. Yamanaka, S. Oka, K. Sato, S. Yamamoto, T. Sado & H. Doi: J. Vis. Exp., 117, e54741 (2016).を採用した（図2図2■（A）印旛沼の低地排水路での採水の様子．カミツキガメは，水深の浅い用水路や，沼の岸近くに生息するので，水底の泥などを巻き込まないよう，バケツよりはむしろ柄の長い柄杓などで採水するほうが実用的である．（B）水の濾過に用いるステリベクスフィルター．シリンジを接続して人力でフィルターする．）．採取した水を実験室に持ち帰り処理する方法は，設備的には大量の水を処理可能だが，移送に伴うリスクが大きく，採取した水の保管状態のコントロールも難しい．また，劣化進行をできる限り押さえるため処理自体も迅速さが要求されるため，多検体を想定した運用にはあまり適さないであろう．ただし，沼の水は川や海の水よりも濁りが強いため，ステリベクス法ではフィルターのつまりが生じて試料採取が困難となる可能性がある．実際，われわれが何カ所かの地点で採取した沼の水では，多くても500 mL程度，水の状態が悪いと100 mLに満たない水量でフィルターが詰まってしまい，処理の限界に達した．海の水では1 L程度は十分処理できるのと比べるとずいぶん少ないが，印旛沼の調査では，結果的にこの量でも十分な生物種が検出でき，実用上は問題ないことがわかった．このようにして，ステリベクスフィルターを用いて現地で採取した試料を実験室に持ち帰り，後日，残渣からの環境DNA抽出を行った⁽⁴⁾4) M. Miya, T. Minamoto, H. Yamanaka, S. Oka, K. Sato, S. Yamamoto, T. Sado & H. Doi: J. Vis. Exp., 117, e54741 (2016).．

図2■（A）印旛沼の低地排水路での採水の様子．カミツキガメは，水深の浅い用水路や，沼の岸近くに生息するので，水底の泥などを巻き込まないよう，バケツよりはむしろ柄の長い柄杓などで採水するほうが実用的である．（B）水の濾過に用いるステリベクスフィルター．シリンジを接続して人力でフィルターする．

次に，得られた環境DNAからカミツキガメが検出されるかを検討した．特定のターゲット生物種がある場合には，その生物種に特異的なプライマーセットを用いたPCRを検討し，検出のパフォーマンスを調べるのが通常である．一方，筆者らは，海水での魚類相調査で環境DNAメタバーコーディング法の経験があり，この方法でもカミツキガメが検出可能であろうと考えた．そこで，カミツキガメ特異的プライマー開発にかける時間などを考慮し，まずは環境DNAメタバーコーディング法を適用して，検出の可能性を検討することとした．

環境DNAメタバーコーディング法では，多種の生物間で保存性の高い領域に挟まれた種特異的配列領域をターゲットとして設定する．そして，保存性の高い領域に設計されたプライマーセットを用いて，環境DNAを鋳型にPCRを行う．このPCRで増幅された断片の内部配列を網羅的に分析すれば，生息する生物種が網羅的に推定できる（図3図3■メタバーコーディング法による分析の流れ）．魚類の場合，MiFishプライマーセットによってMiFish領域をPCR増幅し解析することで，環境DNAを採取した地域に生息する魚類を網羅的に検出可能である．われわれは，これまでの分析例から，カメ類もまた，頻度は低いがMiFishプライマーセットによって検出できることを確認していた．そこで，プライマー配列をうまく最適化すれば，カメ類を感度良く検出可能なのではないか，との考えの元，公共データベースに登録された各種カメの当該部分の配列を検討した．その結果，MiFishプライマー配列の一部を改変することで，広く淡水産カメ類に特異性の高い配列となることがわかった．この配列を利用すれば，魚類由来環境DNAからの増幅を押さえ，カメ類由来環境DNAを特異的に，あるいは優先的に増幅し，検出可能であろう．このようにして，新たなプライマーセットMiTurtleを設計し，効果を検討することとした⁽⁵⁾5) 山川　央，横山　覚，浅見結貴，柴田大輔：“特定外来生物カミツキガメの環境ＤＮＡによる検出の試み”，ConBio2017, 2017.．加えて，同一の試料に対して，従来のMiFishプライマーセットによる分析も行い，検出される生物種を比較検討した．分析法はMiyaら⁽⁶⁾6) M. Miya, Y. Sato, T. Fukunaga, T. Sado, J. Y. Poulsen, K. Sato, T. Minamoto, S. Yamamoto, H. Yamanaka, H. Araki et al.: R. Soc. Open Sci., 2, 150088 (2015).の方法に従い，調製した環境DNAからMiFish領域をPCRによって増幅し，イルミナ社の次世代シーケンサー（以下NGSと表記）であるMiSeqを用いた分析を行った．なお，カメを検出するのにどのくらいのリード数を取得すれば十分なのか不明だったこともあり，まずはできる限りのリード数を確保し検討を行った．

図3■メタバーコーディング法による分析の流れ

採取した水試料から環境DNAを抽出するところまでは特異的プライマーを用いたqPCR分析などと基本的に同じ手順である．PCR時にMiFishなどの種間保存性の高いプライマーセットを用いることで，魚類などのそこに含まれる一群の生物種由来の環境DNAをまとめて増幅し，NGS（次世代シーケンサー）を用いて網羅的に解析，配列情報を取得する．これにより，そこにどのような生物由来の環境DNAが含まれるか，つまり，そこにどのような生物種が存在したかが復元できる．

8月の同日に4地点で採取した試料のうち1地点についての分析結果を図4図4■印旛沼試料の分析結果の例に示す．このセットでは，4地点のうち2地点でカメ類が検出され，うち1地点でカミツキガメが明確に検出された．また，MiTurtleプライマーセットでは，MiFishプライマーセットと比べ，得られた配列データ中に占めるカメ類の割合が非常に高く，カメ類検出に対する有効性は期待どおりであった．リードの深さについては，MiFishで通常読む程度（5万～10万リード）で十分であると考えられた．

この4地点のうち残りの2地点の試料については，PCRによる増幅の効率が悪く，MiFishとMiTurtleのいずれも十分量の増幅産物が得られなかったため，NGSによる分析は行えなかった．増幅効率が悪い原因としては，PCR阻害を引き起こす夾雑物が試料に含まれていることが考えられる．実際，ある1地点由来の試料については，PCR増幅が全く見られなかったが，採取した箇所はアオコのような藻類で覆われており，フィルターの詰まりも酷かったうえに，調製した環境DNA溶液にも明らかな着色があった．印旛沼は，夏場は藻類が多く発生するため，このような状況でも検出可能な系を検討する必要がある．PCR阻害に関しては，阻害物質の除去を手順に組み込んだDNA精製キットがメタゲノム研究用などでいくつも市販されているが，単価が高額なため大量分析には向かないこともあり，今後検討を要する課題である．

図4■印旛沼試料の分析結果の例

同一の試料をMiFishプライマーセットとMiTurtleプライマーセットを用いて分析した．「その他」には主に魚類を含み，印旛沼の例では，コイやフナ，ドジョウなどのほか，ブルーギルやオオクチバスなどの外来魚も含まれている．なお，増幅配列の種類毎に増幅バイアスがかかることが予想されるので，配列ごとに内部標準を入れない限り絶対的な数に意味づけを行うのは危険である．しかしながら，MiTurtleを使用すれば，この図のようにカメ類を強調して検出，視覚化できるため，カメ類の網羅的検出には便利である．

なお，上記の1カ月後，9月下旬にも同一地点で再び採水を行い，同様に環境DNAメタバーコーディング法で分析を行ったところ，先にPCR増幅のかからなかった2地点でも今度はPCRで増幅された．また，全試料でクサガメを主とするカメ類が強く検出され，MiTurtleプライマーセットは期待どおりに機能することを確認できた．

MiTurtleプライマーセットの検出バイアス

配列をカメに最適化したことで，MiFishプライマーセットでは検出感度の悪かったカメ類が感度良く検出できるようになった．それでは，カメの種間検出バイアスはどうだろうか．われわれは，さまざまなカメ由来の試料を用意してこの点についての検討を行った．具体的には，さまざまなカメの血液試料からDNAを抽出し，これらを等量混和して，得られる各々のリード数の，PCR増幅による変動を調べた⁽⁷⁾7) 山川　央，横山　覚，浅見結貴，柴田大輔，宮　正樹：“カメ由来環境ＤＮＡを検出するユニバーサルプライマーの検討”，第65回日本生態学会大会，2018.．

MiTurtleプライマーセットの配列は，基本的には淡水産カメ類にほぼ完全に一致しているため，内部配列の違いによる増幅効率の影響を除けば，さほど大きなバイアスはかからないと考えられる．しかし，アカミミガメとスッポンについては，プライマー認識部位がMiFishプライマーセットに近い配列をもつため，配列に食い違いのあるMiTurtleでは検出されにくくなる可能性がある．実際，MiFishとMiTurtleを用いた分析結果（図5図5■各種カメの血液試料からDNAを調製し，それらをテンプレートとして，MiFishプライマーセットとMiTurtleプライマーセットでPCR増幅し，NGS解析を行った．スッポンとアカミミガメは，MiFishプライマーセットに配列が近いため，MiFishを用いるとほとんどこの2つが増幅されてくる．一方，MiTurtleプライマーセットを用いると，この2つはあまり増幅されず，クサガメ，イシガメが比較的よく増えてくる．）では，MiFishでは，PCR後，ほぼすべてスッポンとアカミミガメのリードになっているが，MiTurtleでは逆に，スッポンとアカミミガメのリードが少ない．また，クサガメとイシガメのリードの割合が増加していることがわかる．厳密な議論のためには合成DNAなどを用いて最初のテンプレート量を厳密に合わせた系での検討が必要だが，それにしても，ユニバーサルなプライマーを用いた包括的分析では定量的な議論が難しいことが改めて示唆されたデータといえる．

図5■各種カメの血液試料からDNAを調製し，それらをテンプレートとして，MiFishプライマーセットとMiTurtleプライマーセットでPCR増幅し，NGS解析を行った．スッポンとアカミミガメは，MiFishプライマーセットに配列が近いため，MiFishを用いるとほとんどこの2つが増幅されてくる．一方，MiTurtleプライマーセットを用いると，この2つはあまり増幅されず，クサガメ，イシガメが比較的よく増えてくる．

カミツキガメ防除への適用の課題

印旛沼のカミツキガメ防除事業は，生息数がたいへん多いことから根絶までには時間がかかると見られている．われわれは，防除の戦略をより効率的に進め，効果を適切に評価する指標として，環境DNA分析技術を適用できないかということで検討を始めた．検出可能性については環境DNAメタバーコーディング法による分析で実証できたが，機動性とコストを考えると，特異的プライマーを用いたqPCRによる検出系をカミツキガメでも検討する必要がある⁽⁸⁾8) C. M. Davy, A. G. Kidd & C. C. Wilson: PLOS ONE, 10, e0130965 (2015).．そこで，現在われわれは，ミトコンドリアDNA上にさまざまなプライマーセットを設計し，比較検討を進めている．

また，今後広範囲での分析を進める際には，PCR阻害物質の影響をいかにして押さえるかが最重要課題と思われた．特に，カメの活動期である夏場には，藻類が繁殖して水の濁りも増える．そのため，フィルターが詰まって処理できる水量が少なくなり，得られる環境DNAの量が少なくなる．一方で，詰まった原因がPCR阻害物質を含む夾雑物の場合，調製した環境DNA中にもPCR阻害物質が高濃度に混入する可能性もある．PCR阻害物質の影響は，最も簡単には原液を希釈すれば低く抑えられる可能性があるが，PCRの鋳型としての環境DNA濃度も希薄になるため，当然検出感度も下がる．阻害物質を除去する精製キットや阻害物質に強いPCRのシステムもさまざま開発されているが，その分コストもかかるので，これらを検討しつつ，安価，簡便で実用的な手法を確立する必要がある．これらについても検討を進める必要がある．

そのほか，現状ではまだまだ改良すべき点は多いが，カミツキガメ防除が進んだ頃には検出手順を確立し，在不在を議論できるようなツールにできればと考え，開発を進めているところである．