発光生物学の最大の謎・発光キノコの光

発光キノコがどのようなメカニズムで発光しているのか？　これは，長年の謎にして発光生物学の最大の疑問とされていたが，2015年から2018年の短い間に，思いがけずその全貌がみるみる解明された（図1図1■研究に使われた八丈島産ヤコウタケMycena chlorophosの子実体（左）とベトナム産Neonothopanus nambiの培養菌糸（右））．

図1■研究に使われた八丈島産ヤコウタケMycena chlorophosの子実体（左）とベトナム産Neonothopanus nambiの培養菌糸（右）

写真提供：山下崇氏（左）．Cassius Stevani博士（右）．

なお，念のために付記すると，発光生物の発光メカニズムは生物ごとに同じではない．発光生物の発光反応は，基本的には「酵素による基質の酸化プロセスにおいて生成されるエネルギーが光として放出されるもの」と理解され，その発光反応にかかわる基質を「ルシフェリン」，酵素を「ルシフェラーゼ」と呼ぶ．しかし，ルシフェリンは，どの生物でも低分子有機化合物という意味では同じだが，その化学構造は発光生物の分類群ごとに全く異なっている．また，ルシフェラーゼについても生物が違えば全く異なるタンパク質が使われていて，たとえばホタルのルシフェラーゼとウミホタルのルシフェラーゼの間にはアミノ酸配列の相同性は一切見られない⁽¹⁾1) 大場裕一，井上　敏：化学と生物，45, 681 (2007)．．

ところで，意外に思われるかもしれないが発光反応メカニズムが完全に解明されている生物─すなわちルシフェリンの化学構造が決定済みで，かつルシフェラーゼの遺伝子がわかっている生物─は決して多くはない．たとえば，ホタルやウミホタル，ウミシイタケ，オワンクラゲ，ヒカリニオガイ，ヒオドシエビ，渦鞭毛藻，発光バクテリア，カイアシ類などについては発光メカニズムが解明されているが，そのほかの大部分の発光生物については，発光メカニズムが部分的にしか解明されていないか，そもそも研究さえ行われていない^{(1, 2)}1) 大場裕一，井上　敏：化学と生物，45, 681 (2007)．2) 金久保暁，久世雅樹，磯部　稔：化学と生物，41, 605 (2003).．そのような中で，発光キノコの発光メカニズムは，これまでにたくさんの研究者が取り組んだにもかかわらず，どうしても解明されることがなかったミステリーだった．

全貌解明の前史

そもそも発光キノコの場合，発光が酵素反応であるのかさえ謎であった．1959年，アメリカのロバート・エアースらは，発光キノコの発光に酵素（ルシフェラーゼ）がかかわっていることを示唆する結果を報告し⁽³⁾3) R. L. Airth & W. D. McElroy: J. Bacteriol., 77, 249 (1959).，ついに解明の手がかりが得られたかに思われたが，その後ルシフェリンの化学構造が明かされることは遂になかった．そうこうする間に，下村脩は発光キノコの反応に酵素がかかわっていない可能性があるという，エアースらの報告とは全く異なる，しかも，これまでの生物発光の基本概念を覆す新仮説を唱えた⁽⁴⁾4) O. Shimomura, S. Satoh & Y. Kishi: Biolumin. Chemilumin., 8, 201 (1993).．

一方，天然物有機化学者たちは，反応に酵素が関与するかどうかはともかく，発光キノコから蛍光性の物質を探索した．一般に，発光反応にかかわる物質は蛍光性（紫外線を照射したときに可視光が放出される性質）をもつ場合が多い．たとえば，中西香爾らはツキヨタケからその候補物質としてイルジンS（別名ランプテロール）を単離し⁽⁵⁾5) M. Endo, M. Kajiwara & K. Nakanishi: Chem. Commun., 6, 309 (1970).，磯部稔らは同じツキヨタケから単離した新規のフラビン化合物をランプテロフラビンと名付けて報告した⁽⁶⁾6) D. Uyakul, M. Isobe & T. Goto: Bioorg. Chem., 17, 454 (1989).．ただし，これらの物質が本当に発光キノコの発光反応に関与しているのかは証明されなかった．

発光キノコルシフェリンの構造が決定

ところが，最近になって，サンパウロ大学のカシウス・ステヴァニらが，発光キノコの発光反応が酵素反応であることを再び報告した⁽⁷⁾7) A. G. Oliveira & C. V. Stevani: Photochem. Photobiol. Sci., 2009, 1416 (2009).．実は，この時点でわれわれもそのことには気付いていたのであるが，そこからの経緯についてはほかに譲るとして⁽⁸⁾8) 大場裕一：きのこ研だより，40, 18 (2017).，結果的にわれわれとロシア科学アカデミーのイリア・ヤンポルスキーらとの共同研究により，2015年ついに発光キノコのルシフェリンの化学構造が明らかとなった⁽⁹⁾9) K. V. Purtov, V. N. Petushkov, M. S. Baranov, K. S. Mineev, N. S. Rodionova, Z. M. Kaskova, A. S. Tsarkova, A. I. Petunin, V. S. Bondar, E. K. Rodicheva et al.: Angew. Chem. Int. Ed., 54, 8124 (2015).．

これまでに提唱されてきた候補物質との大きな違いは，まず，その物質が発光キノコに僅かにしか含まれていなかったこと─このことが解明を難しくしていたのである．もう一つは，ルシフェラーゼが含まれる発光キノコ抽出物にこの物質を加えると実際の発光キノコと同じ緑色の光を放出したこと─つまり発光反応への関与が証明された点である．

果たしてその物質の正体は，「3-ヒドロキシヒスピジン」という，キノコや植物にも存在が知られていた「ヒスピジン」にヒドロキシ基が付加した物質であった（図2図2■上のスキームは，明らかになった発光キノコの発光反応とルシフェリンのリサイクルメカニズム．下は、この４つの遺伝子がゲノム上でタンデムに並んでいる様子．）．

図2■上のスキームは，明らかになった発光キノコの発光反応とルシフェリンのリサイクルメカニズム．下は、この４つの遺伝子がゲノム上でタンデムに並んでいる様子．

ちなみに，発光キノコに含まれているルシフェリンの量が少なかったことをいぶかしく思った読者もいるかもしれない．われわれも最初はその点が不思議であったが，理由はあとになってわかった．発光キノコは，傘が開くと24時間ぼんやりと光り続ける．このように弱く持続的に光るために，発光キノコはルシフェリンをリサイクルしながら僅かな量をゆっくり合成しているようなのだ⁽¹⁰⁾10) Y. Oba, Y. Suzuki, G. N. R. Martins, R. P. Carvalho, T. A. Pereira, H. E. Waldenmaier, S. Kanie, M. Naito, A. G. Oliveira, F. A. Dörr et al.: Photochem. Photobiol. Sci., 16, 1435 (2017).．弱く持続的に光る発光生物は，案外に珍しく，筆者の思いつく限りではほかには発光バクテリアくらいしかない．そして，その発光バクテリアもやはりルシフェリン（脂肪鎖アルデヒド）をごく微量しかもっておらず，少しずつ産生しては発光に使っていることがわかっている．

発光キノコルシフェラーゼが決まる

真のルシフェリンの化学構造がひとたび決まれば，ルシフェラーゼ解明までの道はそう遠くはない．しかし，これほどすぐにその全貌が解明されようとは，かかわったわれわれ自身も予想していなかった．

ルシフェラーゼは，「発現クローニング」という定法でアッという間に解決された．発光キノコに発現しているmRNAの1セットを発現ベクターに組み込み，mRNAにコードされていたタンパク質を酵母細胞に一とおり作らせる．これに3-ヒドロキシヒスピジンを振りかけて，発光する酵母コロニーが見つかれば，それが取り込んでいるベクターに組み込まれているmRNA配列がルシフェラーゼの正体である．原理は単純であるが，この方法はさまざまな要因により（たとえば，ルシフェラーゼがヘテロ二量体だった場合など），必ずしもうまくいくとは限らない．しかし，発光キノコのルシフェラーゼの場合，運良くそれがうまくいったのである⁽¹¹⁾11) A. A. Kotlobay, K. S. Sarkisyan, Y. A. Mokrushina, M. Marcet-Houben, E. O. Serebrovskaya, N. M. Markina, L. G. Somermeyer, A. Y. Gorokhovatsky, A. Vvedensky, K. V. Purtov et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 12728 (2018).．

ついに解明された発光キノコのルシフェラーゼは，28.5 kDaのタンパク質で，これまでに知られているタンパク質とは有意な相同性が全く見られない新規な酵素であった．確認のため，もう一度このルシフェラーゼ遺伝子を酵母細胞に発現させてリコンビナントタンパク質を作り，試験管内で3-ヒドロキシヒスピジンと混ぜたところ，発光キノコと同じ緑色の強い光が再現された．

ゲノム解読により発光メカニズムの全貌が解明

さらに，発光キノコのゲノム解読を行った結果，非常に面白いことがわかった．カフェー酸からヒスピジン（ルシフェリンの前駆体）を生合成する酵素（HispS），ヒスピジンからルシフェリンである3-ヒドロキシヒスピジンへと変換する酵素（H3H），発光反応によって生じるルシフェリン酸化物をカフェー酸へと変換する酵素（CPH），この3つの酵素遺伝子が，ゲノム上でルシフェラーゼ遺伝子（Luz）の隣に並んで遺伝子クラスターを形成していたのである（図2図2■上のスキームは，明らかになった発光キノコの発光反応とルシフェリンのリサイクルメカニズム．下は、この４つの遺伝子がゲノム上でタンデムに並んでいる様子．）．

そこで，CPHを除く3つの酵素遺伝子（＋ヒスピジンの生合成に必要と思われるホスホパンテテニルトランスフェラーゼの遺伝子）を酵母細胞に発現させ，カフェー酸を加えると，発光キノコと同じ緑色の光が現れた．さらに，カフェー酸はチロシンから一つの酵素により生合成されることがわかっているので，この酵素遺伝子も追加で酵母細胞に導入したところ，何とルシフェリンの原料となる物質を何ら加えることなく酵母が緑色に発光した．酵母がもっているチロシンがカフェー酸に変換され，カフェー酸がヒスピジンに変換され，ヒスピジンがルシフェリンへと変換され，ルシフェラーゼの働きによって発光したのだ．

この実験結果は，今後の応用可能性を考えると極めて重要である．つまり，どんな細胞でも5つの遺伝子を導入すればおそらく自前のチロシンを使って自発的に発光させることができるのだ．

実は，発光バクテリアにおいても，ルシフェラーゼとルシフェリン生合成酵素遺伝子がゲノム上にタンデムに並んでいるので，これを使って「光る植物」が作られた例はある．しかし，原核生物と真核生物の転写翻訳システムの違いのせいで，それほど「よく光る」植物はできなかった⁽¹²⁾12) B. Reeve, T. Sanderson, T. Ellis & P. Freemont: “Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology Vol. 2,” eds. by G. Thouand, R. Marks, Springer-Verlag, 2014.．また，ホタルのルシフェラーゼを動物細胞や植物体に発現させた例はいくつもあるが，その場合はホタルルシフェリンを培養液に添加するか植物に直接噴霧しないかぎり発光は起こらない．これらのことを考えれば，真核生物から初めてルシフェラーゼとルシフェリン生合成酵素の遺伝子が決定された今回の成果がいかに革命的であるかがわかっていただけると思う．自ら緑色に発光する人工生物を作ることが，限りなく現実味を帯びてきたのである．

ホタル・発光形質の進化の謎

ホタルは，発光キノコとは対照的に，もっとも早くに発光メカニズムが解明された発光生物の一つである．ルシフェリンの化学構造は1960年代に決定され，ルシフェラーゼの遺伝子も1980年代に明らかになっている（図3図3■ホタルの発光反応（左上）と，アシルCoA合成酵素の触媒する反応（右上）．下は，ホタルゲノム上のルシフェラーゼとアシルCoA合成酵素遺伝子（ACS）の模式図）．

図3■ホタルの発光反応（左上）と，アシルCoA合成酵素の触媒する反応（右上）．下は，ホタルゲノム上のルシフェラーゼとアシルCoA合成酵素遺伝子（ACS）の模式図

ルシフェラーゼとアシルCoA合成酵素にはアミノ酸配列の相同性があり，実際，ホタルルシフェラーゼは脂肪酸をCoA化する活性も併せもっている．

次に解くべき疑問は，ホタルがいかにして発光する能力を獲得しえたのか，という進化の謎である．これまでにわれわれは，ホタルがルシフェラーゼ遺伝子を2つもっていることや，ホタルのルシフェラーゼがアシルCoA合成酵素という脂肪酸代謝にかかわる酵素の一つから進化したこと（図3図3■ホタルの発光反応（左上）と，アシルCoA合成酵素の触媒する反応（右上）．下は，ホタルゲノム上のルシフェラーゼとアシルCoA合成酵素遺伝子（ACS）の模式図），ホタルのルシフェリンがヒドロキノンとシステインから生合成されていることなどを明らかにして，その謎に迫ってきた⁽¹³⁾13) 大場裕一：“恐竜はホタルを見たか”，岩波書店，2016, p. 120.．しかし，さらに深い理解のためには，全ゲノム解読が必要だと思い立ち，ホタルゲノムプロジェクトを立ち上げたのが2014年だった．

日米ホタルゲノムプロジェクト

全ゲノムが解読された動植物は多いが，そのほとんどは人間の暮らしに関係の深い農業作物や，家畜動物，農業害虫，病気を媒介する昆虫などに限られる．当然ながら，その時点で，ホタルの全ゲノムは解読されていなかった．

ところが不思議なもので，われわれがプロジェクトを開始した直後，アメリカMITのグループが同様にホタルゲノムの解読を始めたのである（彼らはクラウドファンディングで研究資金を募っていた）．それからいろいろな経緯があったが，最終的にはわれわれ日本チームとMITチームを主とする国際共同研究により，2018年，ホタルゲノムの解読が達成された⁽¹⁴⁾14) T. R. Fallon, S. E. Lower, C.-H. Chang, M. Bessho-Uehara, G. J. Martin, A. J. Bewick, M. Behringer, H. J. Debat, I. Wong, J. C. Day et al.: eLife, 7, e36495 (2018).．

ちなみに，ゲノム解読に使われたホタルは，日本の代表的な種であるヘイケボタルAquatica lateralisと北米の普通種フォティヌス・ピラリスPhotinus pyralisである（図4図4■ヘイケボタル系統Ikeya-Y90の発光する様子（左）と，アメリカMITでのIkeya-Y90の飼育の様子（右））．実は，われわれがヘイケボタルを選んだのには重要なわけがあった．横浜の高校の先生がヘイケボタルの飼育法を確立し，30年近くものあいだ室内で維持し続けていたほぼ純系の飼育系統があったのだ．ゲノム解読に用いたものと遺伝的に同質な生きた個体を季節に関係なくいつでも実験に使えるということは，ポストゲノミックな今後の研究を展開するうえで非常なアドバンテージであることは言うまでもない．

図4■ヘイケボタル系統Ikeya-Y90の発光する様子（左）と，アメリカMITでのIkeya-Y90の飼育の様子（右）

右の写真はTimothy Fallon博士の提供による．

ちなみに，アメリカチームが解析に使ったフォティヌス・ピラリスは野外個体であり，その飼育法はいまだ確立していない．最近，われわれのヘイケボタル系統は，これを確立した高校の先生の名前をとってIkeya-Y90系統と名付けられ，アメリカMITにも正式に分与された．今や，ヘイケボタルIkeya-Y90はホタル研究のモデル生物となったと言えるだろう．

ホタルルシフェラーゼの進化プロセスが解明

全ゲノム解読とホタル2種のゲノム比較によって明らかになったことは多いが，なかでも最も重要な発見は，ルシフェラーゼ遺伝子の進化に関することであろう．

まず，ホタルはルシフェラーゼ遺伝子を2個もっていることが確定した（ホタルがルシフェラーゼ遺伝子を少なくとも2個もっていることはすでにわれわれが明らかにしていたが，2個以上あるのかどうかについてはゲノムを解読するまでわからなかったのだ）．このLuc1とLuc2と名付けられた2個のルシフェラーゼ遺伝子は，異なる染色体上に乗っていた．お互いに高いアミノ酸相同性があることから，染色体を超えた遺伝子重複によって生じた兄弟遺伝子だと考えられる（図5図5■ゲノムからわかったホタルルシフェラーゼの進化シナリオ）．なお，Luc1は幼虫と成虫の発光器で使われており，Luc2は卵と蛹の体全体に発現していることがわかっている．このように，一つの遺伝子から別れた2つの遺伝子に使い分けが生じることをsubfunctionalization（適当な和訳がない）という．

図5■ゲノムからわかったホタルルシフェラーゼの進化シナリオ

また，ゲノム上のLuc1遺伝子の前後にはルシフェラーゼと相同性のあるアシルCoA合成酵素遺伝子がいくつもタンデムに並んでいることが明らかになった（図5図5■ゲノムからわかったホタルルシフェラーゼの進化シナリオ）．このことは，過去にアシルCoA合成酵素遺伝子がタンデム重複を起こし，その一つがルシフェラーゼへと進化したことを物語る．このように，ある遺伝子が全く新しい機能を獲得することをneofunctionalization（これまた適当な和訳がない）という．ルシフェラーゼ遺伝子の重複はそのあとに起こったと考えられる．

進化生物学においては，新しい機能をもったタンパク質の出現は「遺伝子重複とそれに続いて起こるneofunctionalizationとsubfunctionalizationによって引き起こされる」というのが定説である．それがルシフェラーゼの進化過程にピタリと当てはまったと言えるだろう．

RNA-seqでわかってきたこと

今回の論文では，ゲノム解読に加えて，発生ステージや組織ごとのRNA-seq（特定の組織に発現している遺伝子群とその量を次世代シーケンサーを使って網羅的に解析する方法）も行った．そして，2種のホタルの発光器に特異的に強く発現している酵素遺伝子をリストアップしたところ，興味深いことにシステインの代謝にかかわる遺伝子がいくつか見つかった．これは，ホタルルシフェリンがシステインから生合成されるというわれわれのこれまでの研究結果とのかかわりを考えると示唆的であり，おそらくこれらの遺伝子リストの中にわれわれが探し求めているルシフェリン生合成酵素があるのではないかと想像している．発光キノコの話題の中でも触れたように，ルシフェリンの生合成酵素が解明されれば，その応用的価値が大きく広がっていくことが期待される．

おわりに

発光生物の研究における最新トピックスを2つ紹介した．どちらも，国際共同研究であり次世代シーケンサーを使っている点が，これまでの発光生物研究にはない新しい特徴と言えるだろう．また，比較的どちらも好奇心ファーストで始められた研究であったにもかかわらず，結果的に応用の可能性が大いに見いだされた点も興味深い．

実際のところ，発光生物の研究は世界的に見ても現在あまり盛んに行われているとは言いがたい．しかし，ここに見てきたように，調べてみればまだまだ新しいことの見つかる未開拓な部分が多い分野であることは間違いない．ここで紹介した2つの研究成果も，どちらも掘り起こされたばかりの原石であるから，ここから新しい発見や役に立つツールが今後たくさん見いだされるだろう．本稿を読んで，発光生物の研究に関心をもつ若い研究者が多く現れることを期待したい．なにより，それが役に立とうが立つまいが，生物が自分から光を出すなんて，考えただけでも実に愉快ではないか．