はじめに

洋の東西にかかわらず，発酵食品は古来より健康に良いとされてきた．発酵食品は身体の免疫力を高めると言われており，われわれの健康維持のためには欠かせないものとなっている⁽^{1, 2)}1) 辻啓介：日本醸造協会誌，89, 207 (1994).2) 遠藤明仁，Dicks Leon M.T.: 日本乳酸菌学会誌，19, 152 (2008).．発酵食品の健康効果は，腸内環境を整えることにより，栄養価の消化吸収がよくなり，便秘予防，血中コレステロール値の低下，免疫力が高まるなどの効果がある．健康食品の生体にとって有用な未知なる分子を解析することを目的とし，発酵食品のなかでも食卓になじみの深い食品の一つである納豆に着目した．納豆は，古来より日本の発酵食品の代表格である．ちなみに納豆の起源は諸説あるが，秋田県横手市のJR奥羽本線“後三年”駅付近の金沢公園の中には，「納豆発祥の地」の碑が建っており，後三年の役（1083～1087年）に納豆が作られ，後に広まったとされている⁽¹⁾1) 辻啓介：日本醸造協会誌，89, 207 (1994).．納豆には人体に不可欠な必須アミノ酸群をバランスよく含んでおり，ビタミンB2・E・Kなどのビタミン群，カリウム・亜鉛・カルシウム・鉄などのミネラル成分，食物繊維などの栄養素も豊富である⁽³⁾3) 秋田県雄物川町教育委員会編：“雄物川町郷土史資料”．納豆の効用は，栄養的な面だけでなく納豆菌自体の優れた作用に負うところが大きい．すなわち，納豆菌は胃酸にも耐えて腸にたどりつき，ビフィズス菌や乳酸菌の増殖を促進して整腸作用を発揮し，便通を改善する．また，ウェルシュ菌や大腸菌などがつくる腐敗産物の生成を減少させ，有害物質を吸着して排泄を促すことから肝臓の負担を軽くし，肌や各組織にも良い影響を与えるものと考えられている．

納豆の健康効果を挙げると，疲労回復，整腸作用，便通促進，滋養強壮，コレステロールの代謝を促す，免疫力アップ効果，活性酸素の働きを抑え体の老化やがんを防ぐ，肌や皮膚を若々しく保つ，などがマスコミや一般書籍などで多数紹介されているが，納豆のいかなる成分が効果を発揮するのかなどの科学的分析報告はあまりなく，科学的解析はナットウキナーゼ位である⁽³⁾3) 秋田県雄物川町教育委員会編：“雄物川町郷土史資料”．われわれは，納豆抽出成分を生化学的に分離し，各種培養がん細胞に対する影響を解析した．

納豆硫酸アンモニウム分画の培養がん細胞に及ぼす影響

納豆，テンペ，または煮豆（100 g）に300 mLの10 mM Tris–HCl（pH 7.4）を加え，ポリトロンホモジナイザーで全体が均一に滑らかになるまでホモジナイズし，15,000 rpm, 15 min, 4°Cで遠心分離した．上清を回収し，飽和硫酸アンモニウム濃度が0～30％（分画A），30～50％（分画B），50～75％（分画C），および75～100％（分画D）で硫酸アンモニウム分画（硫安分画）した．遠心分離後の沈殿部分を10 mM Tris–HCl（pH 7.4）で溶解し，同バッファーに一晩透析して，透析後に凍結乾燥を行い，サンプルとして回収した．HeLa細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞）に，各分画を終濃度1 mg/mLになるよう投与した．24時間後の顕微鏡画像解析の結果，コントロール，納豆抽出成分非硫酸アンモニウム分画成分投与HeLa細胞には顕著な変化は観察できなかった．一方，硫酸アンモニウム分画成分投与群のなかでも30～50％飽和分画では，接着細胞であるHeLa細胞すべてが死滅し，球状となり浮遊していた．納豆抽出液硫酸アンモニウム分画成分Bには，強力な抗がん作用のあることが判明した（図1図1■納豆抽出液硫酸アンモニウム分画によるがん細胞死滅効果）．

図1■納豆抽出液硫酸アンモニウム分画によるがん細胞死滅効果

納豆菌，または煮豆でも同様の効果があるのか解析した結果，どちらも全く抗がん効果は認められなかった（図2図2■HeLa細胞に対する納豆菌と煮豆成分の影響）．同様に，煮豆にテンペ菌を添加したインドネシアの納豆とも呼ばれるテンペでも同様の実験を行ったが，抗がん効果は全く確認出来なかった．HeLa細胞以外の培養がん細胞でも，効果を解析した．Neuro 2A細胞（マウス神経芽細胞腫由来株），PC12細胞（ラット副腎褐色細胞腫）でも同様の結果であった（図3図3■HeLa細胞以外のがん細胞に対する納豆抽出液アンモニウム分画Bの影響）．ほかにも，HepG2細胞（ヒト肝臓がん由来細胞株），SHSY5Y細胞（ヒト神経芽細胞腫）など，接着タイプの培養がん細胞では同一結果となり，がん細胞は死滅し浮遊した．一方，浮遊細胞のRaji細胞（ヒトバーキットリンパ腫Bリンパ球様細胞株）では，驚いたことに細胞が消失し，よく見ると細胞破片のような小さな物質が確認された（図4図4■Raji細胞（ヒトバーキットリンパ球様細胞）への納豆抽出液硫酸アンモニウム分画Bの影響）．このように，納豆硫酸アンモニウム分画Bには，強力な抗がん活性が認められた．

図2■HeLa細胞に対する納豆菌と煮豆成分の影響

図4■Raji細胞（ヒトバーキットリンパ球様細胞）への納豆抽出液硫酸アンモニウム分画Bの影響

図3■HeLa細胞以外のがん細胞に対する納豆抽出液アンモニウム分画Bの影響

枯草菌の種類，および発酵方法の異なる納豆のがん細胞，およびヒト正常細胞に及ぼす影響

枯草菌，および発酵法の異なる8種類の試作納豆を山田フーズ（株）より入手し，同様の実験を行った．HeLa細胞に対する死滅効果は，枯草菌YF160を使用した納豆が強力であった．このため，HeLa細胞，およびヒト胎児肺由来正常2倍体線維芽細胞（WI38細胞）に対する影響も解析した（図5図5■がん細胞と正常細胞に対するYF160枯草菌納豆硫酸アンモニウム分画Bの比較）．各々の細胞の左は顕微鏡画像，右は48時間培養後のシャーレをクーマシーブリリアントブルーR250染色した結果である．YF160枯草菌納豆抽出液Bでは，0.15 mg/mLでHeLa細胞が死滅するのに対し，同濃度でWI38細胞は60％位生存しており，YF160枯草菌納豆抽出液硫酸アンモニウム分画Bは，正常細胞よりもがん細胞を特異的に死滅させることが判明した．

図5■がん細胞と正常細胞に対するYF160枯草菌納豆硫酸アンモニウム分画Bの比較

納豆由来抗がん活性成分の同定

納豆の抗がん活性成分を同定するため，納豆抽出成分の硫酸アンモニウム分画Bをアニオン，またはカチオン交換カラムクロマトグラフィー，およびブチルセファロースカラムクロマトグラフィーを行い，分画成分をRaji細胞に添加し，死滅成分をさらに精製した．図6図6■納豆由来の5 kDaがん細胞死滅因子の同定は，ブチルセファロースカラムクロマトグラフィーのTris/Tricine SDS-PAGEの結果である．Raji細胞が死滅した分画に共通するのは，矢印で示した約5 kDaのペプチドであり，ブチルセファロースカラムクロマトグラフィーを重ねることにより，5 kDaのペプチドを単離し，抗がん活性を確認した．さらに，アミノ酸シークェンスを行った結果，図7図7■納豆由来抗菌・抗がんペプチドに示すように，サブチリシンのC末端付近の45残基のアミノ酸からなるペプチドであることが判明した．二次構造を推定した結果，αヘリックスに富む両親媒性で，数残基ごとに塩基性アミノ酸からなる等電点9.40のペプチドと推定された．このペプチドは，以下の特徴を併せ持つ抗菌ペプチドと推定された（図7図7■納豆由来抗菌・抗がんペプチド）．

図6■納豆由来の5 kDaがん細胞死滅因子の同定

図7■納豆由来抗菌・抗がんペプチド

①10～数十アミノ酸残基からなり，分子中に多くの塩基性アミノ酸を含み，生理的条件下で正電荷を帯びる．②両親媒性の立体構造をとり，膜中などの疎水的環境下ではαヘリックス構造やβシート構造などの多様な二次構造を示す．③抗菌ペプチドは正電荷を帯びているため，酸性リン脂質が多く存在し負に帯電している微生物の細胞膜と静電相互作用により強く結合する．

このように，納豆に含まれる抗がん作用を示す成分は，新規の抗菌ペプチドであることが判明した（特許第6464507号）．

抗菌ペプチドの抗がん剤への応用

抗菌ペプチド（AMP: anti-microbial peptide）は，動物の第一選択防御メカニズムの一つである⁽⁵⁾5) J. M. Schroder: Cell. Mol. Life Sci., 56, 32 (1999).．これらの遺伝子にコードされた10～50アミノ酸残基のポリペプチドは，哺乳動物の皮膚や上皮粘膜などのバクテリア感染が起こりうるバリア部位に戦略的に配置されるか，もしくは細胞内に侵入した微生物反応を検出することにより，傷害部位や感染部位に迅速に送達される．ヒトにおける主要な2つのAMPファミリーは，ディフェンシン，およびカテリシジンであり⁽⁶⁾6) F. Pinheiro da Silva & M. C. Machado: Peptides, 36, 308 (2012).，どちらも好中球および上皮細胞によって産生され，実際に肺およびほかの組織免疫において同様の役割を共有している⁽⁷⁾7) T. Tecle, S. Tripathi & K. L. Hartshorn: Innate Immun., 16, 151 (2010).．自然免疫と適応免疫の両方を活性化する哺乳動物の免疫システムとは対照的に，昆虫などでは，これらの病原体が激しく豊富に存在する環境下では，バクテリアに対してはAMP一族に頼っている⁽⁸⁾8) L. Jr Otvos: J. Pept. Sci., 6, 497 (2000).．ほとんどのAMPはpH＝7.0ではカチオン性であり，すなわちAMPの配列は，正電荷を帯びたアミノ酸残基，アルギニン（R），リジン（K），およびヒスチジン（H）を，また負電荷を帯びたアスパラギン酸（D），およびグルタミン酸（E）を含む．AMPの作用機序は，負に荷電した細菌膜表面への膜透過・膜崩壊をもたらす閾値レベルまでの蓄積であることは極めて論理的であるように思われる⁽⁹⁾9) Y. Shai: Curr. Pharm. Des., 8, 715 (2002).．

多くのがん細胞表面には，正常細胞と比較し，フォスファチジルセリンやムチンなどの陰性荷電分子が高発現するため，抗菌ペプチドによって膜破壊が誘導される．このため，一部のカチオン製抗菌ペプチドは独特な抗がん能力をもち，多くのがん細胞に強力な殺傷作用をもつことが発見された．たとえばセクロピンは，昆虫や哺乳動物の免疫血リンパ中に広範に存在する34～39残基のアミノ酸からなるペプチドである．セクロピンファミリーのうち，セクロピンB（Cecropin B; CB）は強力な抗菌作用と細胞溶解特性をもつ両親媒性ポリカチオンペプチドである．CB1aは，いくつかのがん細胞株に抵抗する活性をもち，正常細胞に対する毒性は小さい⁽¹⁰⁾10) C. Y. Huang, H. Y. Huang, M. D. Forrest, Y. R. Pan & H. M. Chen: PLOS ONE, 9, e109174 (2014).．動物実験によると，CB1aは，ヒトの肺がん細胞を移植したマウスの腫瘍増大を大きく抑制することができたことが報告されている．このほかにも，地中海の海洋被嚢類（ホヤの一種）のAplidium albicansから単離されたPlitidepsinは，肺カルチノイド，悪性黒色腫，神経芽細胞腫，白血病，多発性骨髄腫，リンパ腫の治療が期待されている．現在Plitidepsinは主に人工合成法で得られ，すでに第III相臨床研究（Phase III）に入っている⁽¹¹⁾11) L. Van Andel, S. Fudio, H. Rosing, S. Munt, B. Miguel-Lillo, I. González, M. M. Tibben, N. de Vries, A. H. M. de Vries Schultink, J. H. M. Schellens et al.: Invest. New Drugs, 35, 589 (2017).．

納豆抗菌ペプチドの展望

納豆抗菌ペプチドは，ヒト培養固形がん，および非固形がん細胞を死滅させ，ヒト正常細胞の生育には影響を与えなかった．また，今回データは示さないが，ヒトがん幹細胞に対する抗がん効果は，抗がん剤のシスプラチンやアドリアシンよりも強力であった．皮膚がんや，悪性黒色腫，口腔がんなどへの応用も考え，動物実験を予定している．納豆抗菌ペプチドは，抗菌作用のスペクトルは狭いものの，肺炎レンサ球菌，緑膿菌を死滅させる⁽¹²⁾12) M. Kitagawa, T. Shiraishi, S. Yamamoto, R. Kutomi, Y. Ohkoshi, T. Sato, H. Wakui, H. Itoh, A. Miyamoto & S. Yokota: AMB Express, 7, 127 (2017).（図8図8■納豆抗菌ペプチドの肺炎レンサ球菌抗菌活性）．現在，ヒト単純ヘルペスI型の治療にはアシクロビルが使用されているが，ウィルスの活性抑制のため，再発が予想される．納豆抗菌ペプチドは，ヒト単純ヘルペスI型を死滅させることが明らかとなった．さらに，ヒトノロウィルス（NV）の細胞培養系はいまだに確立されていないため，ノロウイルスと同じカリシウイルス科に属するネコカリシウイルス（FCV）が培養可能である．納豆抗菌ペプチドとポリリジン併用により，ネコカリシウィルス（ヒトのノロウィルス）が死滅したことから，JNC（株）と共同で，抗ウィルス剤としての国内特許申請中であり，また，国際特許申請準備中である．

図8■納豆抗菌ペプチドの肺炎レンサ球菌抗菌活性