デジタルPCRとは

1種検出系の環境DNA手法では，多くの場合，リアルタイムPCR装置を用いて環境DNAを解析してきた．しかし近年では，次世代（第3世代）PCRと呼ばれるデジタルPCR法が実用化され，研究に用いられつつある．本稿でのデジタルPCRは，デジタルドロップレットPCR（digital droplet PCR; ddPCR）を主に扱う．これは，DNAサンプルを油膜で区切られた粒（ドロップレット）に小分けして分析する手法である（たとえば，BioRad製デジタルPCR）．約2万個の2ピコリットルのドロップレットのなかでDNAをPCRで増幅させてプローブなどにより蛍光標識し，そのドロップレットごとの蛍光の有無について解析する（図1図1■デジタルPCR（BioRad,QX-100）の原理．BioRad社より提供）．デジタルデータから絶対定量ができることから，リアルタイムPCRよりも高精度でDNA量を定量でき，さらにPCR阻害に強いと考えられている⁽⁹⁾9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).．

図1■デジタルPCR（BioRad,QX-100）の原理．BioRad社より提供

われわれの研究グループでは，デジタルPCRとリアルタイムPCRについて環境DNA分析における性能を検証する2つの実験を行った^{(9, 10)}9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).．Doiら⁽⁹⁾9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).では，デジタルPCRとリアルタイムPCRにおける環境DNAを用いた生物量の定量の検出精度について，メソコズム実験の水サンプルに含まれるコイ（Cyprinus carpio）の環境DNA量から検討した．さらに，Doiら⁽¹⁰⁾10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).では，ため池の水サンプルに含まれるブルーギル（Lepomis macrochirus）の環境DNAの在・不在について，デジタルPCRとリアルタイムPCRでの検出感度やPCR阻害による分析への影響の違いについて検討した．

個体数・生物量の定量へのデジタルPCRの利用

環境DNA量から魚の個体数を推定する手法についてデジタルPCRとリアルタイムPCRの性能を比較するため，メソコズムによる操作実験を行った．約450 Lのメソコズム12基において，それぞれ，0～85個体のコイを飼育して，その飼育水から環境DNAを採集して解析した．その結果を用いて，コイの環境DNA量とその個体数・生物量の関係について検討した⁽⁹⁾9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).．

実験は，広島大学理学部に設置されている野外実験水槽を12基用いて行った（図2図2■コイ飼育実験の水槽（450 L））．各水槽（約450 L）に実験7日前に水道水を入れ，実験開始までくみ置きした．また，1基の水槽はコイを入れない対象区とした．採水は，コイを入れる前（コントロール，0日），1日目，2日目，3日目に実施した．また，途中で死亡した個体については体重を測定して，実験水槽から取り除いた．

図2■コイ飼育実験の水槽（450 L）

環境DNAはエタノール沈殿法により表層水から抽出した．水槽中央部において，1.5 mLの3 M酢酸ナトリウムを入れておいた50 mL遠沈管に15 mLの水をピペットで採水した．採水後すぐに33 mLエタノールを入れた後，−20°Cにて冷凍保存した．その後，高速冷却遠心機（条件：10,000 g, 1時間，4°C）で遠心して上澄みを除き，Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kitを用いて，沈殿物からDNAを抽出・精製した．多くの環境DNA調査では，山中⁽⁵⁾5) 山中裕樹：化学と生物，57, 380 (2019).にあるように，DNA濃縮処理はグラスファイバーフィルターかカートリッジフィルターを用いているが，このように，エタノール，もしくはイソプロパノールを用いた沈殿法による手法がある^{(2, 11)}2) G. F. Ficetola, C. Miaud, F. Pompanon & P. Taberlet: Biol. Lett., 4, 423 (2008).11) L. R. Nathan, M. D. Simmons, B. Wegleitner, C. L. Jerde & A. Mahon: Environ. Sci. Technol., 48, 12800 (2014).．本手法は分析に供することができる水サンプル量が少ないという欠点はあるが（15～30 mL），調査現場で，エタノール，もしくはイソプロパノールを添加することで環境DNAの減衰を防ぐことができるという特徴があり，野外での長期調査などに活用できる可能性がある．

環境DNA量については，リアルタイムPCR（StepOne, Life technologies）とデジタルPCR（QX-100, Bio-Rad）の両手法を用いて解析を行った．コイのプライマープローブについては，リアルタイムPCR，デジタルPCR共に同じものを用いて分析を行った．これら2つの手法にて定量された環境DNA量と飼育実験の個体数との関係を比較した．

環境DNAと個体数・生物量について，リアルタイムPCRとデジタルPCR共に高い精度で解析できた．しかし，低濃度の環境DNAにおいては，デジタルPCRで測定値のばらつきが小さく，より高精度に測定できることがわかった（図3, 4図3■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA量とコイの個体数との関係図4■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA量とコイの生物量との関係）．測定のばらつき（CV: Coefficients of variation）については，特に低濃度の環境DNAにおいてデジタルPCRで低くなることがわかった（図5図5■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA測定におけるCoefficient of variation（CV）とDNA量の関係）．

図3■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA量とコイの個体数との関係

直線はType II回帰の結果を示す．Doiら^（9）9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).を改変．

図4■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA量とコイの生物量との関係

直線はType II回帰の結果を示す．Doiら^（9）9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).を改変．

図5■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した環境DNA測定におけるCoefficient of variation（CV）とDNA量の関係

中央のグラフはCV値のボックスプロットを示す（横線：中央値，箱：±25％四分位，エラーバー: 1.5x ±25％四分位）．Doiら^（9）9) H. Doi, K. Uchii, T. Takahara, S. Matsuhashi, H. Yamanaka & T. Minamoto: Minamoto PLOS ONE, 10, e0122763 (2015).を改変．

生物種検出へのデジタルPCRの利用

こちらの実験⁽¹⁰⁾10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).には，ため池70個から採集した環境DNAサンプル⁽³⁾3) T. Takahara, T. Minamoto & H. Doi: PLOS ONE, 8, e56584 (2013).を用いた．ブルーギルの環境DNAが検出された池とされていない池を計25個選び，それらの池のサンプルについて，デジタルPCRを用いてブルーギルのDNA量を測定した．さらに，ブルーギルの人工DNAの希釈系を作成して，ブルーギルDNAが非検出のため池の環境DNAサンプルに入れて検出力を評価した．

デジタルPCRを用いた場合，ブルーギルの環境DNAの測定において，リアルタイムPCRよりも検出率が高いことがわかった．これはデジタルPCRが，検出感度が高くさらにPCR阻害に強いためと考えられた（図6図6■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定したブルーギル環境DNAの測定における検出率（8繰り返し中）とDNA量の関係）．また，ブルーギルの人工DNAを添加した実験からも同様の結果が得られ，デジタルPCRはPCR阻害に強く，検出力が高いことが示された（図7図7■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した添加した環境DNAの測定における検出率（8繰り返し中）とDNA量の関係）．

図6■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定したブルーギル環境DNAの測定における検出率（8繰り返し中）とDNA量の関係

Doiら^（10）10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).を改変．

図7■リアルタイムPCRとデジタルPCRで測定した添加した環境DNAの測定における検出率（8繰り返し中）とDNA量の関係

Doiら^（10）10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).を改変

これらの結果より，デジタルPCRは，リアルタイムPCRと比較して検出感度・精度が共に優れていることが示された⁽¹⁰⁾10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).．これらの結果はNathanら⁽¹¹⁾11) L. R. Nathan, M. D. Simmons, B. Wegleitner, C. L. Jerde & A. Mahon: Environ. Sci. Technol., 48, 12800 (2014).によっても支持されている．一方で，デジタルPCRはドロップレットの作成や蛍光の測定などに時間が必要であり，おおむねリアルタイムPCRの3倍の時間を要し，分析価格もリアルタイムPCRよりも高い⁽¹⁰⁾10) H. Doi, T. Takahara, T. Minamoto, S. Matsuhashi, K. Uchii & H. Yamanaka: Environ. Sci. Technol., 49, 5601 (2015).．したがって，今後の普及や改良によりこれらの欠点が解消されれば，リアルタイムPCRに置き換わって，環境DNA測定の標準的な手法として普及する可能性がある．

遺伝型の検出：Cycleave PCR

近年，同種内の遺伝的に異なる外来集団（同種内外来遺伝子型）の侵入が大きな問題となっている．外来遺伝子型の個体は，形態などの見た目で在来種と区別がつかないため，その同定や検出は非常に困難である．さらに，外来種として認識されにくいだけでなく，外来遺伝子型は在来種との交雑によって遺伝子浸透を引き起こす可能性が高いため，生物多様性保全における重大なリスクとなっている．このような遺伝子型の違いを検出するための手法として，塩基配列を元に種を特定する環境DNA手法が有効である可能性がある．その手法として，ここでは，Uchiiら⁽¹²⁾12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).により，1塩基の多型（SNP）を検出できるCycleave PCRを利用した手法を紹介する．

コイの在来型と外来型遺伝子の検出

Uchiiら⁽¹²⁾12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).では，日本在来のコイと人為導入された外来のコイをモデルとし，在来遺伝子型と外来遺伝子型を区別する変異である，ミトコンドリアDNAのD-loop領域に存在する一塩基多型（SNP）を特異的に検出・定量するCycleave PCR法の開発を行った．コイについては，日本列島在来のコイ（Cyprinus carpio）以外に，人為導入によりユーラシア大陸系統のコイが日本全国の湖沼・河川に広く分布を拡大しつつあることが問題となっている．まず，在来および外来遺伝子型それぞれに特異的な，SNP部のみをRNAに置換した短い（11塩基）DNA-RNA-DNAプローブ2種と，プローブ配列を含むDNA断片を増幅するコイ特異的なプライマーペアを設計した．これら2種のプローブとプライマーペアを用い，RNA分解酵素Hを含んだリアルタイムPCRを行うと，図8図8■1遺伝子多型検出に用いるCycleave PCR法の原理に示すように，プローブ配列とターゲット配列が完全にマッチすれば，RNA分解酵素HによりDNA-RNAハイブリッドのRNA部分が切断され，プローブの蛍光が発せられる．なお，2種のプローブは異なる蛍光物質で標識されているため，在来遺伝子と外来遺伝子を同時に検出・定量することができる．

図8■1遺伝子多型検出に用いるCycleave PCR法の原理

Uchiiら^（12）12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).を改変．

Cycleave PCR法によって，在来および外来遺伝子型のDNA比が正しく定量できるかどうかを確認するために，まず，在来および外来遺伝子型由来のDNAを異なる比率で混合したDNA溶液（DNA比スタンダード）を鋳型として，Cycleave PCRを行った．その結果から，DNA比（外来DNAコピー数／在来DNAコピー数）とΔC_T値（C_T在来プローブ–C_T外来プローブ）の検量線を作成したところ，Cycleave PCR法により得られたDNA比とΔC_Tの検量線は，外来／在来DNA比が0.07から15の範囲で直線性を示すと同時に，鋳型DNA量が150, 1,000, 20,000（コピー／反応）のどの場合も検量線はほぼ同一であった（図9図9■Cycleave PCRより得られた在来DNA／外来DNA比とΔC_T（C_T在来–C_T外来）の検量線）．よって，開発されたCycleave PCR法は，鋳型DNA量にかかわらず，在来または外来遺伝子型どちらかのDNAが約6％以上存在すれば，これらのDNA比を正確に定量できることがわかった．

図9■Cycleave PCRより得られた在来DNA／外来DNA比とΔC_T（C_T在来–C_T外来）の検量線

Uchiiら^（12）12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).を改変．

さらに，在来遺伝子型と外来遺伝子型を異なるバイオマス比（在来／外来＝0.1, 0.2, 0.7, 1.7, 4.0, 9.8）で飼育する水槽実験を行った．コイを異なる遺伝子型比率で飼育した6つの水槽水から得られた環境DNA試料中のDNA比をCycleave PCR法によって定量した．その結果，環境DNA試料より定量された外来DNAの割合と，環境DNAから測定された外来遺伝子型のバイオマスの割合の関係には傾きがほぼ1の強い正の相関が検出された（図10図10■コイの生物量の割合と在来／外来DNAの割合との関係）．つまり，外来DNAの割合は外来遺伝子型バイオマスの割合と1 : 1の関係をもっていた．

図10■コイの生物量の割合と在来／外来DNAの割合との関係

Uchiiら^（12）12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).を改変．

そこで，西日本の23地点の水域に本手法を適用し，コイ地域個体群における外来遺伝子型の侵入レベルの推定を行った．そのうち17水域においてコイの外来／在来DNA比の定量値が得られ，本手法が野外調査に適用可能であることが確認されるとともに，西日本の多くの水域において，外来遺伝子型の侵入が進んでいることが示唆された（図11図11■西日本の河川および貯水池において推定された在来および外来遺伝子型の割合）．したがって，Cycleave PCRを用いた環境DNA分析を用いれば，外来遺伝子型の生物量割合，つまり外来遺伝子型の侵入レベルを迅速かつ広域に推定できることが示唆された．将来，Cycleave PCRを用いた環境DNA手法が，外来遺伝子型の侵入を評価する迅速な手法として活用されることが期待される．

図11■西日本の河川および貯水池において推定された在来および外来遺伝子型の割合

円グラフ中の数字は外来遺伝子型の割合（％）Uchiiら^（12）12) K. Uchii, H. Doi & T. Minamoto: Mol. Ecol. Resour., 16, 415 (2016).を改変．

現場分析：モバイルPCR

モバイルPCRは，ハンディタイプの高速リアルタイムPCR装置として，日本板硝子（株）によって開発されたものである．装置は外付けバッテリーで駆動させることができるため，野外での測定が可能である．さらに，PCR試薬をヒーター間で行き来させる新たな温度制御法を導入することで，素早く温度の切り替えが可能であり，高速なサーマルサイクリングが可能となった（図12図12■モバイルPCRで用いられている新技術の原理）．これにより，環境DNA研究で一般的なPCRサイクル数（40～50サイクル）においても，15分程度（試薬に依存する）で測定が可能である．これは通常のリアルタイムPCR（約2時間）と比べて格段に早い．さらに，光ファイバーを用いた新たな蛍光検出法を開発し（図12図12■モバイルPCRで用いられている新技術の原理），小型化を実現し，ハンディでの利用を可能にした．

図12■モバイルPCRで用いられている新技術の原理

このモバイルPCRを利用することで，河川や湖沼で汲んだ水に含まれるDNAを現場で分析し，水生生物の生息の有無を30分以内に把握するシステムを開発した．環境DNAについては，ステリベクスカートリッジフィルターを用いてろ過を行い，現場での抽出（手法は現在は開発中）とモバイルPCRによる分析を行った．実地試験は，利根川の外来魚ハクレンを対象に，Farringtonら（2015）によるハクレン種特異的プライマープローブを用いて解析を行った．これらのシステムを用いて，環境DNAによるハクレンの生息状況の把握性能を確認するため，河川水辺の国勢調査による既存調査とも比較したところ良好な検出結果を得た（図13図13■利根川でのモバイルPCRによる外来魚ハクレンの環境DNA検出の結果）．

図13■利根川でのモバイルPCRによる外来魚ハクレンの環境DNA検出の結果

これらのことから，モバイルPCRにより，環境DNAから水生生物の生息の有無を30分以内に把握するシステムを開発できたと考えている．今後の野外での環境DNA検出手法の開発にとって，モバイルPCRは非常に有用な技術であると考えられる．今後は多くの生物種に適用するとともに，さらに高精度かつ高速での分析を目指して開発を進めている．