1. 水田土壌のメタトランスクリプトーム解析

これまで，水田土壌において窒素固定反応を駆動している微生物群を明らかにするために，分離培養やPCRに基づく手法が多く用いられてきた⁽⁵⁾5) S. Ishii, S. Ikeda, K. Minamisawa & K. Senoo: Microbes Environ., 26, 282 (2011).．特に，窒素固定の鍵酵素の一つであるDinitrogenase reductaseをコードするnifHを対象としたPCR法による窒素固定微生物の群集構造解析は，これまで多く報告されている⁽⁵⁾5) S. Ishii, S. Ikeda, K. Minamisawa & K. Senoo: Microbes Environ., 26, 282 (2011).．しかし，分離培養法では難培養微生物を取り逃がす可能性⁽⁶⁾6) R. I. Amann, W. Ludwig & K. H. Schleifer: Microbiol. Rev., 59, 143 (1995).，PCRベースの手法ではその条件設定やプライマーのミスマッチにより，微生物群集の多様性を低く見積もってしまう可能性が指摘されている^{(7, 8)}7) S. Hong, J. Bunge, C. Leslin, S. Jeon & S. S. Epstein: ISME J., 3, 1365 (2009).8) C. M. Jones, D. R. Graf, D. Bru, L. Phillippot & S. Hallin: ISME J., 7, 417 (2012).．近年，このPCRによるバイアスを回避するため，また，特定の対象遺伝子のみならずさまざまな機能遺伝子を包括的に解析するため，環境DNAやRNAを直接シーケンサーに供し，大量のシーケンスデータを得るメタゲノム・トランスクリプトーム解析が盛んに利用されている．しかしながら，実際の水田ほ場を対象とした，窒素固定反応を含むさまざまな窒素循環や炭素循環に関与する細菌群の包括的・総合的な一斉評価は行われていない．さらに，それらの活性の指標となる土壌由来のRNAに基づく解析についてもいまだ行われておらず，上述した反応を駆動する細菌群のin situでの転写プロファイルについてもほとんどわかっていない．このように，水田土壌において物質循環を駆動する細菌群についての包括的な理解は，これまで達成されてこなかった．そこでわれわれは，水田土壌を対象としたメタトランスクリプトーム解析を行い，窒素固定のみならず各種の窒素循環や炭素循環反応を駆動する細菌群の全体像を明らかにすることを試みた^{(9, 10)}9) Y. Masuda, H. Itoh, Y. Shiratori, K. Isobe, S. Otsuka & K. Senoo: Microbes Environ., 32, 180 (2017).10) Y. Masuda, H. Itoh, Y. Shiratori & K. Senoo: Soil Sci. Plant Nutr., 64, 455 (2018).．本稿においては，窒素固定反応を駆動する微生物群について述べる．

水田土壌メタトランスクリプトーム解析に用いる土壌は，新潟県農業総合研究所内の連作水田ほ場において土壌の酸化還元電位（Eh）を指標とし，水田土壌が最も還元的になる湛水期，最も酸化的になる落水期に採取した（図1図1■新潟水田土壌のほ場管理と酸化還元電位の年間変動）．土壌採取には円筒コアを用い，上層土壌（0～1 cm）ならびに下層土壌（5～7 cm）を分取し，RNAを抽出した後，Miseqシーケンサー（Illumina）に供してショットガンシーケンスした．窒素固定反応を触媒する酵素NitrogenaseはnifD, nifK，がコードするDinitrogenase，およびnifHがコードするDinitrogenase reductaseからなる酵素複合体である⁽¹¹⁾11) L. M. Rubio & P. W. Ludden: J. Bacteriol., 187, 405 (2005).．得られたメタトランスクリプトームデータから，これらnifD, nifK, nifHすべての配列を抽出して由来微生物について解析を行った．

図1■新潟水田土壌のほ場管理と酸化還元電位の年間変動

培養法やPCRベースの解析から，ほかの陸域環境と同様に水田土壌においても，Cyanobacteria門の光合成細菌やActinobacteria門，Alpha-, Beta-, Gamma-proteobacteria綱の細菌群が主に窒素固定を行っている，というのが通説であった^{(12, 13)}12) 辻村茂男：“新・土の微生物(7)生態的に見た土の原生動物・藻類”，土壌藻類の働きと利用，博友社，2000, pp. 127–158.13) B. Reinhold-Hurek & T. Hurek: Trends Microbiol., 6, 139 (1998).．しかしながら，われわれの行ったメタトランスクリプトーム解析では，そのような従来よく知られた窒素固定細菌群のものよりも，Deltaproteobacteria綱細菌由来のnif転写産物がはるかに高頻度に検出された（図2図2■新潟水田土壌メタトランスクリプトーム解析によって検出された窒素固定遺伝子（nif）転写産物の微生物組成）．そのなかでも，これまで世界的に水田土壌に優占することが知られ，鉄還元反応を駆動する細菌として有名なAnaeromyxonbacterやGeobacter属細菌のnif転写産物が高頻度に検出された．このことから，これまで窒素固定への関与が全く議論されてこなかったこれら鉄還元菌こそが，水田土壌において窒素固定を駆動しているキープレーヤーであることが初めて示唆された⁽⁹⁾9) Y. Masuda, H. Itoh, Y. Shiratori, K. Isobe, S. Otsuka & K. Senoo: Microbes Environ., 32, 180 (2017).．

図2■新潟水田土壌メタトランスクリプトーム解析によって検出された窒素固定遺伝子（nif）転写産物の微生物組成

（A）Phylum, proteobacteriaの綱レベル，（B）Delta-proteobacteria綱の属レベル

2. 鉄還元菌窒素固定はユビキタスか

AnaeromyxobacterおよびGeobacter属細菌といった鉄還元菌由来の窒素固定遺伝子は水田土壌のみで検出されるのか，それともほかの水田土壌や陸域環境においても同様であるのか？　これを明らかにするために，われわれは国内各地の水田，雑草地，畑，森林の土壌，そして河川の底泥を対象としてメタゲノム解析を行った．さらに，国内だけでなく世界各地の土壌においてもこれら鉄還元菌由来の窒素固定遺伝子が検出されるのかを調査するため，公共データベースサーバー（MG-RAST；⁽¹⁴⁾14) F. Meyer, D. Paarmann, M. D’Souza, R. Olson, E. M. Glass, M. Kubal, T. Paczian, A. Rodriguez, R. Stevens, A. Wilke et al.: BMC Bioinformatics, 9, 386 (2008).にアップロードされている世界各地の土壌メタゲノムデータも収集し，窒素固定遺伝子を抽出して同様の解析を行った．その結果，AnaeromyxobacterおよびGeobacter属の鉄還元菌由来の窒素固定遺伝子は水田土壌のみならず，河川の底泥，森林，極地，雑草地，畑，砂漠土壌などほとんどの土壌環境から検出された（unpublished）．また，窒素固定遺伝子自体の検出頻度は森林・畑・雑草地土壌よりも水田土壌や河川の底質において有意に高いこと，そうした窒素固定遺伝子が豊富に検出される環境ほど鉄還元菌の窒素固定遺伝子の検出頻度も極めて高いことが明らかとなった．これらのことから鉄還元菌窒素固定が陸域環境におけるユビキタスな現象であること，また土壌圏の窒素固定力の大部分を支えている可能性も示唆された．

3. なぜ鉄還元菌窒素固定は見落とされてきたのか

AnaeromyxobacterおよびGeobacter属は，それぞれ通性嫌気性および偏性嫌気性細菌（Bergey’s manual）であり，これまでに鉄やウランをはじめとした複数種類の金属の還元反応や，有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン反応を行うことが報告されている^(15～19)15) R. A. Sanford, J. R. Cole & J. M. Tiedje: Appl. Environ. Microbiol., 68, 893 (2002).19) R. T. Anderson, H. A. Vrionis, I. Ortiz-Bernad, C. T. Resch, P. E. Long, R. Dayvault, K. Karp, S. Marutzky, D. R. Metzler, A. Peacock et al.: Appl. Environ. Microbiol., 69, 5884 (2003).．水田土壌中における主な機能もまた鉄還元と考えられてきた⁽²⁰⁾20) T. Hori, A. Müller, Y. Igarashi, R. Conrad & M. W. Friedrich: ISME J., 4, 267 (2010).．また，16S rRNA遺伝子のPCRアンプリコンシーケンシングに基づく群集構造解析から，水田土壌の最優占微生物群の一つであることも世界的に知られている^(21～23)21) H. Itoh, S. Ishii, Y. Shiratori, K. Oshima, S. Otsuka, M. Hattori & K. Senoo: Microbes Environ., 28, 370 (2013).23) Y. Kim & W. Liesack: PLOS ONE, 10, e0122221 (2015).．上記のグローバルなメタゲノム解析の結果もAnaeromyxobacterおよびGeobacter属細菌が陸域環境に普遍的に存在していることを示している．このように両属細菌に着目した研究は多く，実環境中において決してレアな細菌群ではないことは明らかである．しかしながら，これほどに陸域環境中に豊富かつ普遍的に存在するのにもかかわらず，これまでのPCRベースの解析においてこれら鉄還元菌由来の窒素固定遺伝子やその転写産物が環境中から高頻度に検出されたことはほとんどなかった．この「たくさんいるのに窒素固定遺伝子は検出されなかった」という矛盾はなぜ生じてきたのだろうか．

たくさんいるのにもかかわらず，従来のPCRベースの解析法では検出できなかった原因としてまず考えられることは，環境試料中の窒素固定遺伝子のPCR増幅のために用いられてきたプライマー配列のミスマッチである．しかしながら，表1表1■鉄還元菌のnifH遺伝子配列とプライマーの相同性比較に示したように，従来用いられてきたnifHのプライマーでは，これら鉄還元菌由来のnifH配列に対してミスマッチが散見されたものの，相同性の高い鉄還元菌のnifHも複数存在した．このことから，プライマー配列のミスマッチだけが，これまで見落とされてきた原因ではないと考えられた．次にGC含量を調べたところ，両属の鉄還元菌の窒素固定遺伝子はほかの細菌由来の遺伝子に比べて高いことが判明した．特にAnaeromyxobacterはゲノム全体のGC含量が73％を超えており，GC含量が最も高い細菌群の一つであることもわかった．一般的に高GC含量の塩基配列は，PCR法において増幅されにくいことが知られている．事実，GC含量が70％を超えるAnaeromyxobacter属細菌のnosZ（脱窒反応における亜酸化窒素還元の鍵酵素遺伝子）は，プライマー配列が完全にマッチしてもPCR増幅できないことが報告されている⁽⁸⁾8) C. M. Jones, D. R. Graf, D. Bru, L. Phillippot & S. Hallin: ISME J., 7, 417 (2012).．また興味深いことに，Anaeromyxobacterはゲノム全体や機能遺伝子はGC含量が高いものの，16S rRNA遺伝子だけは58％程度と極端に低く，一般的な細菌と同程度であった（表2表2■鉄還元菌とこれまで知られてきた窒素固定菌の遺伝子とgenomeのGC含量の比較）．このGC含量の極端な差が，16S rRNA遺伝子のPCRアンプリコンシーケンシングに基づく群集構造解析でよく検出されるのにもかかわらず，窒素固定遺伝子は検出されない，すなわち「たくさんいるのに鉄還元菌窒素固定は見落とされてきた」矛盾の背景にあると考えられた．

表1■鉄還元菌のnifH遺伝子配列とプライマーの相同性比較

表2■鉄還元菌とこれまで知られてきた窒素固定菌の遺伝子とgenomeのGC含量の比較

4. 鉄還元菌の単離培養と窒素固定能の検証

このようにオミクス解析から水田土壌の窒素固定において鉄還元菌が重要な役割を果たしている可能性が示唆された．しかしながら，これらのオミクス解析は遺伝子やその転写産物を対象としたものにすぎず，実際に鉄還元菌が窒素固定能を有しているのか，土壌環境中で窒素固定能を発揮できるのかについては不明である．上述のとおり，鉄還元菌は16S rRNAベースの解析から水田土壌に優占していることは古くから示唆されてきており，またゲノム情報も登録されているものの，環境中からその窒素固定遺伝子が検出されることはほとんどなかったため，その窒素固定能に着目した研究は限られている．さらには，水田土壌の優占種でありながら水田土壌からの単離培養例がほとんどなく，種記載などの系統学的な整理が行われていなかった．特にAnaeromyxobacter属細菌に関しては単離培養例自体が数例しかなく，記載種も2002年に登録されたA. dehalogenasが知られるのみである．そこで，水田土壌からの鉄還元菌の単離培養と，その単離培養株を用いた生化学的解析による鉄還元菌の窒素固定能の検証を行った．

一般的にAnaeromyxobacterおよびGeobacter属の鉄還元菌は酢酸を電子供与体，フマル酸や酸化鉄III（Fe^3＋）などを電子受容体とした最少培地を用いた集積培養を経て単離培養されている．本研究では視点を変え，「水田土壌に優占しているのであれば水田土壌で集積できるはず」という作業仮説のもと，水田土壌そのものを使って鉄還元菌を集積培養することを試みた．風乾した水田土壌と蒸留水をバイアル瓶に入れ，オートクレーブ滅菌した．この土壌スラリーに生土試料を添加し，気相を無酸素ガスで置換して1～2週間おきに継代した．継代培養後の土壌スラリーは有機酸を添加したR2A agar培地（幅広い細菌を培養できる培地）に塗布して嫌気培養し，生えてきたコロニーを純化した．このような集積培養スクリーニングの結果，国内各地の水田土壌からAnaeromyxobacterやGeobacter属細菌を複数株単離することに成功した^{(24, 25)}24) Z. Xu, Y. Masuda, H. Itoh, N. Ushijima, Y. Shiratori & K. Senoo: Front. Microbiol., (2019).25) Masuda et al., submitted.．

本研究で水田土壌から単離したAnaeromyxobacter属細菌の複数株をゲノム解読したところ，すべてがnifHDKを保有していた．また窒素固定遺伝子クラスターの構造を調べたところ，窒素固定活性を示すことが報告されているほかのDelta-proteobacteria属細菌の構造とよく似ており，nifHDKENBが保存されていることがわかった⁽²⁵⁾25) Masuda et al., submitted.（図3図3■鉄還元菌とその近縁細菌の保有する窒素固定遺伝子クラスタの比較）．さらに，水田土壌から単離したAnaeromyxobacter属細菌は窒素ガスを封入すれば無窒素培地でも増殖し，またその時に窒素固定遺伝子の転写量が高まった．そして，滅菌した水田土壌にこのAnaeromyxobacter属細菌を接種したところ，土壌で窒素固定活性が検出されるとともに，土壌中でのAnaeromyxobacter属細菌の増殖も確認された⁽²⁵⁾25) Masuda et al., submitted.．これらのことから，Anaeromyxobacter属細菌は窒素固定活性を有すること，水田土壌中で窒素固定能を発揮できることが明らかとなった．非常に基礎的な検証実験であるものの，これはAnaeromyxobacter属細菌の窒素固定能を活性レベルで証明した初めての報告である．

図3■鉄還元菌とその近縁細菌の保有する窒素固定遺伝子クラスタの比較

Anaeromyxobacter属細菌と同時にGeobacter属細菌も単離されたが，驚くべきことに記載種との16S rRNA遺伝子配列の相同性が98.0％以上を示すものはなく，すべての株が新種であることが示唆された．さらにゲノム相同性や各種生理性状試験から，その大部分が従来のGeobacter属とは異なる特徴を示すこと，分子進化系統樹上でも独立した系統群を形成することが判明し，新属“Geomonas”属と提唱した⁽²⁴⁾24) Z. Xu, Y. Masuda, H. Itoh, N. Ushijima, Y. Shiratori & K. Senoo: Front. Microbiol., (2019).（図4図4■新たにわれわれが提唱したGeomonas属細菌ならびにGeobacter属細菌の系統樹）．Geobacter属の新種株も含め，このGeomonas属細菌もまた窒素固定遺伝子を保有し，窒素固定活性を示すことを確認した（unpublished）．

図4■新たにわれわれが提唱したGeomonas属細菌ならびにGeobacter属細菌の系統樹

これまでAnaeromyxobacter属およびGeobacter属細菌のうち，Geobacter属細菌の僅か2種（G. metallireducens, G. sulfurredcens）しか窒素固定能の活性レベルでの検証が行われてこなかった^{(26, 27)}26) D. A. Bazylinski, A. J. Dean, D. Schüler, E. J. Phillips & D. R. Lovley: Environ. Microbiol., 2, 266 (2000).27) M. V. Coppi, C. Leand, S. J. Sandler & D. R. Lovley: Appl. Environ. Microbiol., 67, 3180 (2001).．本研究により，水田土壌由来のAnaeromyxobacter属，Geobacter属，さらにはGeomonas属細菌が窒素固定活性を示すことが証明され，鉄還元菌窒素固定の重要なエビデンスを得ることができた．