1. CLOCKとNPAS2

時計制御因子の中で最初にヘムの結合が報告されたのは，CLOCKのパラログとして見つかったNPAS2である⁽¹⁰⁾10) M. Reick, J. A. Garcia, C. Dudley & S. L. McKnight: Science, 293, 506 (2001).．NPAS2は，SCNやそのほかのほとんどの細胞に存在し，CLOCKと同様にBMAL1とヘテロダイマーを形成して時計遺伝子のE-boxに結合し体内時計を制御する．CLOCKのノックアウトマウス（Clock^−/−）が野生型に比べて周期が短くなるものの日周リズムを維持できることから，NPAS2はSCNでも肝臓などの周辺組織でもCLOCKの機能を相補できると考えられる^{(11, 12)}11) J. P. DeBruyne, D. R. Weaver & S. M. Reppert: Nat. Neurosci., 10, 543 (2007).12) D. Landgraf, L. L. Wang, T. Diemer & D. K. Welsh: PLOS Genet., 12, e1005882 (2016).．一方で，NPAS2機能を阻害したマウスは夜間に異常な睡眠パターンを示し摂食スケジュールの変化に順応できず，Clock^−/−マウスをさらにNPAS2機能阻害（つまりはCLOCK/NPAS2ダブル機能阻害）したマウスは日周リズムが維持できないということがわかってきた⁽¹³⁾13) C. A. Dudley, C. Erbel-Sieler, S. J. Estill, M. Reick, P. Franken, S. Pitts & S. L. McKnight: Science, 301, 379 (2003).．こうした結果は，CLOCKが光によるSCNの主要体内時計の制御にかかわり，NPAS2が摂食やホルモンなどによって制御されるリズムにかかわる，というモデルを示唆するが，そのメカニズムの全容，およびCLOCKとNPAS2の体内時計制御での働きの違いの詳細などはいまだ不明な点が多い．

CLOCK, NPAS2, BMAL1は，低酸素誘導因子HIF-1やダイオキシン受容体AHRやその核輸送体ARNTなどと同様に，basic helix loop helix-Per Arnt Sim（bHLH-PAS）ファミリーに属する転写因子である（図3図3■コア時計制御因子のPAS構造）．約50アミノ酸からなるbHLHドメインは，4～6個の塩基性アミノ酸と2つのαヘリックスとそれをつなぐループ部分を含み，DNA結合部位を形成する（図4図4■bHLH-PASドメインの高次構造）．PASドメインは，Per Arnt Simに共通する5本鎖のβシーツと中央のαヘリックスからなるカゴのような高次構造から名付けられ，ホモダイマー形成やほかのタンパク質とのヘテロダイマー形成に重要である．CLOCKとNPAS2は，それぞれ約110個のアミノ酸からなるPASAとPASBの2つのドメインを含み，ドメイン間で高い相同性を示す．それぞれホモダイマーでもE-boxに結合するが，BMAL1とヘテロダイマーを形成してDNAに結合した場合のみ転写活性化能をもつ．活性型のヘテロダイマーの形成とDNA結合活性は，NAD（P）Hによって活性化される^{(14, 15)}14) J. Rutter, M. Reick, L. C. Wu & S. L. McKnight: Science, 293, 510 (2001).15) K. Yoshii, F. Tajima, S. Ishijima & I. Sagami: Biochemistry, 54, 250 (2015).．

図3■コア時計制御因子のPAS構造

CP: Cys-Pro heme recognition motif, CBD: CRY-binding domain, TAD: Transactivation domain, HAT: Histone acetyltransferase

図4■bHLH-PASドメインの高次構造

（A）ヒトCLOCK bHLH/BMAL1 bHLH/DNAの結晶構造緑：CLOCK bHLH, 青: BMAL1 bHLH, ピンク：E-box （CACGTG） （PDB: 4H10）（B）大腸菌酸素センサーEc-DOSのPASドメイン構造（PDB: 1V9Y）とNPAS2 PASAドメインのホモロジーモデリング水色・緑：Ec-DOSのPASダイマー，青スティック：ヘム，ピンク：NPAS2 PASA, His76/Met94: Ec-DOSのヘム軸配位子，His119/His171: NPAS2のヘム軸配位子（C）マウスCLOCK/BMAL1の結晶構造（PDB: 4F3L）緑: CLOCK bHLH PASA/B, 青：BMAL1　bHLH PASA/B, 緑：CLOCK, 青：BMAL1, 赤：NPAS2軸配位子His119/His171にそれぞれ相当するCLOCKのHis144/His196

NPAS2は，PASA, PASBドメインにそれぞれ1 : 1でヘムを結合し，Fe^2＋-ヘムへのCO結合によってNPAS2/BMAL1ヘテロダイマーのDNA結合活性が阻害される⁽¹⁶⁾16) E. M. Dioum, J. Rutter, J. R. Tuckerman, G. Gonzalez, M. A. Gilles-Gonzalez & S. L. McKnight: Science, 298, 2385 (2002).．NPAS2 PASAのFe^2＋ヘムはPASBのFe^2＋ヘムに比べ約10倍COと結合しやすいため，COセンサーとしてはPASAドメインが主に機能していると考えられている．そこでわれわれはNPAS2のPASAタンパク質あるいはbHLH-PASAタンパク質を大腸菌発現系を用いて精製し，ヘムの結合状態をUV-Visスペクトル，共鳴ラマンスペクトルを用いて解析おこなった．その結果，酸化型Fe^3＋ヘム結合型のPASAタンパク質では主にHis119/Cys170を軸配位子とする六配位構造をとるが，bHLH-PASAタンパク質ではHis119/His171が軸配位子となることから，bHLHとPASAドメイン間の相互作用が示唆された^{(17, 18)}17) T. Uchida, T. Uchida, E. Sato, A. Sato, I. Sagami, T. Shimizu & T. Kitagawa: J. Biol. Chem., 280, 21358 (2005).18) T. Uchida, I. Sagami, T. Shimizu, K. Ishimori & T. Kitagawa: J. Inorg. Biochem., 108, 188 (2012).．また還元型Fe^2＋ヘム結合型は六配位構造で軸配位子はHis119/His171であることがわかった．したがって，Fe^2＋ヘムへのCOの結合時にはおそらく動きやすいHis171がCOと置き換わりセンサードメインの構造が変わると考えられる．NPAS2の活性とヘムについて解析したところ，NPAS2 bHLH-PASA野生型のBMAL1とのヘテロダイマー形成やそのDNA結合活性は，ヘムの結合の有無やヘム鉄の酸化還元状態（Fe^2＋, Fe^3＋）によって変化しなかった⁽¹⁹⁾19) M. Ishida, T. Ueha & I. Sagami: Biochem. Biophys. Res. Commun., 368, 292 (2008).（図5図5■マウスNPAS2 PASAヘムセンサードメインの構造とDNA結合／転写活性）．さらに変異体解析から，H119A変異体とH171A変異体はいずれもDNA結合活性が消失し，一方でC170A変異体の活性は野生型と変わらなかった．COの効果は，PASAドメイン内のHis, Cysを含む多数の変異体が野生型と同様にCOによって活性が阻害されるのに対し，C170A変異体のみがCO応答性を示さなかった．以上の結果は，ヘムの軸配位子近傍の構造がNPAS2のDNA結合活性の制御に重要で，COのヘムへの結合で誘起されたPASAドメインの立体構造変化はbHLHドメインへ伝達されDNA結合活性に影響を与えることを示している．加えて，動物培養細胞を用いたNPAS2依存的な転写活性に対してもヘムの効果，COの効果，PASAドメインの変異の効果がDNA結合活性に対するのと同様にみられたことから，実際の細胞内でもNPAS2はヘムを結合しCOセンサーとして働いていると考えられる．

図5■マウスNPAS2 PASAヘムセンサードメインの構造とDNA結合／転写活性

NOはCOと同様にNPAS2の還元型へムに結合するが⁽³⁾3) T. Shimizu, D. Huang, F. Yan, M. Stranava, M. Bartosova, V. Fojtíková & M. Martínková: Chem. Rev., 115, 6491 (2015).，NO添加によって野生型のDNA結合活性はむしろ増加した（未発表）．さらに，NOが結合していないFe^3＋ヘムのNPAS2でもNOによるDNA結合活性の増加が観察されたことから，NOの効果にNPAS2ヘム鉄への結合は関与しないと考えられる．この結果は，NPAS2のDNA結合活性は，COシグナルとNOシグナルを介して，それぞれ異なる機構によって制御されることを示唆している．

CLOCKについては，大腸菌で発現し精製したCLOCK bHLH-PASAへのFe^3＋ヘムの結合はNPAS2と同様に六配位構造を取ることが示唆された⁽²⁰⁾20) G. S. Lukat-Rodgers, C. Correia, M. V. Botuyan, G. Mer & K. R. Rodgers: Rodgers: Inorg. Chem., 49, 6349 (2010).．ごく最近FreemanらによってNPAS2のHis119に相当するHis144がCLOCK bHLH-PASA（Fe^3＋ヘム）の軸配位子の一つであることが報告されたが⁽²¹⁾21) S. L. Freeman, H. Kwon, N. Portolano, G. Parkin, G. U. Venkatraman, J. Basran, A. J. Fielding, L. Fairall, D. A. Svistunenko, P. C. E. Moody et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 19911 (2019).，もう一方の軸配位子はまだ特定されていない．また，彼らは，ヘムの結合していない（アポ）CLOCK bHLH-PASAのホモダイマーのDNA結合活性は，ヘムの添加によって阻害されると報告した．これに対して，われわれは，CLOCK bHLH-PASAのBMAL1 bHLH-PASAとのヘテロダイマー形成やヘテロダイマーのDNAの結合活性はヘムの結合やヘム鉄へのCO結合によってほとんど変化しないという結果を得ている（未発表）．これはCLOCKのCOのヘム鉄への親和性（K_d＝ca. 0.1 mM at 22°C）⁽²⁰⁾20) G. S. Lukat-Rodgers, C. Correia, M. V. Botuyan, G. Mer & K. R. Rodgers: Rodgers: Inorg. Chem., 49, 6349 (2010).が，NPAS2の場合（K_d＝1–2 μM at 25°C）⁽¹³⁾13) C. A. Dudley, C. Erbel-Sieler, S. J. Estill, M. Reick, P. Franken, S. Pitts & S. L. McKnight: Science, 301, 379 (2003).に比べて低いことを反映しているかも知れない．さらに，動物細胞にNPAS2あるいはCLOCKをBMAL1と共発現させるといずれも核に局在して発現するがNPAS2/BMAL1共発現のときのみ核がヘム染色で染まる⁽²²⁾22) R. Itoh, K. Fujita, A. Mu, D. H. T. Kim, T. T. Tai, I. Sagami & S. Taketani: FEBS Lett., 587, 2131 (2013).．以上の結果はNPAS2は細胞核で実際にヘムを結合しヘムあるいはヘムを介した体内時計の制御に関与しうることを示唆しているが，一方でCLOCKについては核内でヘムと結合しているかどうかは不確かで今後さらに解析が必要である．

これまでに，NPAS2の結晶構造はヘムの結合していないアポ型，結合しているホロ型ともに報告されていない．それに対して，CLOCKとBMAL1のbHLH-PASA, Bヘテロダイマーの結晶構造⁽²³⁾23) N. Huang, Y. Chelliah, Y. Shan, C. A. Taylor, S. H. Yoo, C. Partch, C. B. Green, H. Zhang & J. S. Takahashi: Science, 337, 189 (2012).，およびE-box DNAに結合したCLOCKとBMAL1のbHLHヘテロダイマーの構造が解析されている⁽²⁴⁾24) Z. Wang, Y. Wu, L. Li & X. D. Su: Cell Res., 23, 213 (2013).（図4図4■bHLH-PASドメインの高次構造）．さらに，ごく最近，CLOCKのPASAホモダイマーの結晶構造⁽²¹⁾21) S. L. Freeman, H. Kwon, N. Portolano, G. Parkin, G. U. Venkatraman, J. Basran, A. J. Fielding, L. Fairall, D. A. Svistunenko, P. C. E. Moody et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 19911 (2019).も報告されたが，いずれもヘムの結合していないアポ型CLOCKである．これらCLOCKのPASAドメインはこれまで報告されたほかのPASタンパク質によく似た構造をしている⁽³⁾3) T. Shimizu, D. Huang, F. Yan, M. Stranava, M. Bartosova, V. Fojtíková & M. Martínková: Chem. Rev., 115, 6491 (2015).．しかし，CLOCKやNPAS2は，バクテリアの酸素センサーFix-LやEc-DOSと同様にHisを軸配位子とするが，PASドメイン内の予想されるヘムの結合位置は，Fix-LやEc-DOSなどのPASドメインへのヘムの結合位置と異なっている．Fix-LやEc-DOSのPASセンサードメインはタンパク質のN端側に存在し，Fe^2＋ヘムへのO₂の結合あるいは解離によってPASドメインの高次構造が変化し，その情報がC端側にあるエフェクタードメインへ伝達されそれぞれキナーゼ活性やホスホジエステラーゼ活性を調節する⁽³⁾3) T. Shimizu, D. Huang, F. Yan, M. Stranava, M. Bartosova, V. Fojtíková & M. Martínková: Chem. Rev., 115, 6491 (2015).．一方で，CLOCKやNPAS2では，PASセンサードメインの構造変化は，タンパク質N端側のbHLHドメインへ影響を与えDNA結合活性を制御する．これらのセンサードメインのヘムの結合位置は，それぞれの情報伝達ドメインとのドメイン間相互作用の違いを反映していると考えられる．

2. PER

ヘムは，またPER1やPER2のPASドメインにも結合することが報告されている^{(25, 26)}25) K. Kitanishi, J. Igarashi, K. Hayasaka, N. Hikage, I. Saiful, S. Yamauchi, T. Uchida, K. Ishimori & T. Shimizu: Biochemistry, 47, 6157 (2008).26) K. Hayasaka, K. Kitanishi, J. Igarashi & T. Shimizu: Biochim. Biophys. Acta, 1814, 326 (2011).．PER2は，2つのPASドメインだけでなく，さらにC端側にCys-Pro（CP）モチーフを含むもう一つのヘム結合サイトを持っている⁽²⁷⁾27) J. Yang, K. D. Kim, A. Lucas, K. E. Drahos, C. S. Santos, S. P. Mury, D. G. S. Capelluto & C. V. Finkielstein: Mol. Cell. Biol., 28, 4697 (2008).（図3図3■コア時計制御因子のPAS構造）．PASドメインへはFe^3＋ヘムあるいはFe^2＋ヘムいずれも結合するが，Fe^3＋ヘムの結合ではCysを軸配位子の一つとする六配位構造をとる．また，アポ型PER2 PASAとホロ型NPAS2 bHLH PASAを共存させるとヘムがNPAS2からPER2へ移動することから，それによってNPAS2の機能を制御しているのではないかと示唆されている．しかし，PER2 PASドメインへのヘムの結合は非特異的であるとの報告⁽²⁸⁾28) M. V. Airola, J. Du, J. H. Dawson & B. R. Crane: Biochemistry, 49, 4327 (2010).もあり，in vivoでの有意性についてはさらなる解析が必要である．一方，CPモチーフのCys（ヒトPER2ではCys841）には酸化型Fe^3＋ヘムのみ結合し，ヘムの結合はin vivoでPER2タンパク質の分解を促進しCRYとの結合を阻害する⁽²⁷⁾27) J. Yang, K. D. Kim, A. Lucas, K. E. Drahos, C. S. Santos, S. P. Mury, D. G. S. Capelluto & C. V. Finkielstein: Mol. Cell. Biol., 28, 4697 (2008).．したがって，PER2のCPモチーフへのヘムの結合は細胞の酸化還元センサーとして働き，タンパク質の安定性を制御することによって体内時計に影響を与えると考えられる．

3. REV-ERB

体内時計のコアループを形成するREV-ERBは，核内レセプターファミリーに属し，時計遺伝子の発現に対してネガティブな制御因子として働く．REV-ERBは，Fe^3＋ヘムとC端側のリガンド結合ドメイン（LBD）に1 : 1で結合し，ヒトREV-ERBβの場合Cys384とHis568が内部軸配位子である^(29～32)29) S. Raghuram, K. R. Stayrook, P. Huang, P. M. Rogers, A. K. Nosie, D. B. McClure, L. L. Burris, S. Khorasanizadeh, T. P. Burris & F. Rastinejad: Nat. Struct. Mol. Biol., 14, 1207 (2007).30) E.-J. Woo, D. G. Jeong, M. Y. Lim, K. S. Jun, K. J. Kim, S. M. Yoon, B. C. Park & R. Eon: J. Mol. Biol., 373, 735 (2007).31) K. I. Pardee, X. Xu, J. Reinking, A. Schuetz, A. Dong, S. Liu, R. Zhang, J. Tiefenbach, G. Lajoie, A. N. Plotnikov et al.: PLoS Biol., 7, e43 (2009).32) E. Matta-Camacho, S. Banerjee, T. S. Hughes, L. A. Solt, Y. Wang, T. P. Burris & D. J. Kojetin: J. Biol. Chem., 289, 20054 (2014).（図6図6■（A）ヒトREV-ERBのドメイン構造）．還元型Fe^2＋ヘムの結合では，Cys384の配位がはずれて，His568を軸配位子とする五配位構造あるいはHis568とまだ未特定の中性アミノ酸残基を軸配位子とする六配位構造の混合となる．Cys384はCys374とジスルフィド結合をしヘムの親和性を下げる．さらに還元型Fe^2＋ヘムには，NOやCOが結合し六配位構造をとる（図7図7■ヒトREV-ERBβのヘムセンサードメインの構造と抑制活性）．実際に，ヘム存在下で動物培養細胞にREV-ERBαを発現させると，NPAS2/BMAL1共発現のときと同様に核のヘム染色が顕著に増加することから，in vivoでもREV-ERBはヘムと結合し核に局在すると考えられる⁽²²⁾22) R. Itoh, K. Fujita, A. Mu, D. H. T. Kim, T. T. Tai, I. Sagami & S. Taketani: FEBS Lett., 587, 2131 (2013).．また，REV-ERBの機能に対するヘム結合の効果については，当初のin vitroの結果と異なり⁽³¹⁾31) K. I. Pardee, X. Xu, J. Reinking, A. Schuetz, A. Dong, S. Liu, R. Zhang, J. Tiefenbach, G. Lajoie, A. N. Plotnikov et al.: PLoS Biol., 7, e43 (2009).，in vivoでヘム結合はむしろ完全長のREV-ERBβとコリプレッサーNCoR1の相互作用を阻害し，REV-ERBタンパク質の分解を促進し，標的遺伝子の一つであるBmal1の発現を活性化することが最近報告された⁽³³⁾33) L. Yin, N. Wu, C. J. Curtin, M. Qatanani, N. R. Szwergold, R. A. Reid, G. M. Waitt, D. J. Parks, K. H. Pearce, G. B. Wisely et al.: Science, 318, 1786 (2007).．一方でFe^2＋ヘムへのNOの結合は，REV-ERBの転写抑制活性を減少させる（リプレッサーとして不活性型）．CO結合は同様の効果を示すがNOに比べ効果は1/6程度である．以上の結果は，REV-ERBがin vivoでヘムだけでなくNOのセンサーとして体内時計を制御していることを示している．

図6■（A）ヒトREV-ERBのドメイン構造

DBD: DNA binding domain・Zn-finger, LBD: ligand binding domain（B）ヒトREV-ERBβのLBDドメインの結晶構造　薄緑：アポ型（PDB: 2V0V），緑：ホロ型（PDB: 3CQV）

図7■ヒトREV-ERBβのヘムセンサードメインの構造と抑制活性

neutral donor: His or Pro