はじめに

近年，海洋環境における難分解性のプラスチックごみ（プラごみ）汚染の問題が大きくクローズアップされている．なかんずく，太陽光紫外線により劣化したプラスチックが，マイクロプラスチック化して，海洋生態系に深刻な影響をもたらす可能性が指摘され，この問題の対策は海洋の保全において喫緊の課題となってきている．さらに，2015年には「国連持続可能な開発サミット」において，人類社会にとって持続可能な開発目標として17のゴールと169の対策が採択され（Sustainable Development Goals; SDGs），その第14番目のゴールに「海の環境を守ろう」がうたわれて，海洋のプラごみ問題は人類共通の課題としてその解決が迫られてきている．

海洋環境に流出したプラごみは，海水より比重の重いものは直ちに沈下して，海底に蓄積される．また，私たちの生活で一番よく使われているポリエチレンやポリプロピレンなどの，海水より比重の軽いプラスチックはしばらく海水上を漂ったあげく，その一部は海岸に打ち上げられ紫外線により劣化しマイクロプラスチック化する．また海洋プラごみの大部分は付着生物や藻類などの付着により比重が増加して，最終的には深海底まで沈降していく．事実，「しんかい6500」などの大深度深海調査船などで深海底に潜ってみると，やたらにプラごみが目につく⁽¹⁾1) 藤倉克則，奥谷　喬，丸山　正（編）：“深海調査船の観た深海生物”，東海大学出版，2018.．図1図1■深海底で観察されたプラごみに，私どもが実際に深海底で確認したプラごみの写真を示す．

図1■深海底で観察されたプラごみ

プラごみが環境に与える負荷はその自然界における難分解性にあるので，代替プラスチックとして環境中の微生物により分解可能な「生分解性プラスチック（生プラ）」が，盛んに開発されるようになってきた．ただし，プラスチック素材における生分解性を鑑みるに，脱水縮合系ポリマーやラジカル重合してできるオレフィン系など社会的インフラに大きく根付いている現状のプラスチックに対して生分解処理を試みたり，その利便性（強度や保存性）に完全に置き換えていくのは難しい現状があるが，新規生プラ素材の開発は時代的要請ともなってきている．しかしながら，こうして開発された生プラの生分解性の試験・評価は，陸上環境でのみなされ，塩分濃度が高い海洋環境では行われてこなかった．なかんずく，塩分に加え，低温・高水圧下の深海環境での分解性試験の例は皆無であった．上に述べたようにプラごみの多くが海洋環境に流出されること，そして最終的には深海底に蓄積されることなどを考えると，生プラ素材の海洋環境，特に深海環境での分解性の確認は必須のように思われる．そうした背景の元に，筆者らは，2007年より生プラ分解性を有する深海微生物の探索，同微生物による生プラ素材の分解性の試験，評価を行ってきたので，本稿ではその研究概要と成果について解説する．

生分解性プラスチックの深海微生物による分解性

そもそも，生プラの素材としては既にいろいろな種類が開発され，市場で利用されている．ここでは，生プラ素材として一番利用されている，Aliphatic polyesterに着目して試験を行った．その結果，低温・高水圧下の深海環境では，容易に分解できるものと分解できないものとがあることが確認された．ここでは，生プラ分解性を有する深海微生物の探索と，その微生物を利用した生プラ素材の分解性について記述する．

1. 生プラを分解する深海微生物の探索

2007年度には2つの深海調査航海（有人深海調査船「しんかい6500」利用航海，YK07-14，および，無人深海探査船ROV「かいこう7KII」利用航海，KR07-14）を提案し，これらの調査航海に参加し，千島海溝水深3500 mおよび日本海溝水深5,000～7,000 mの深海底泥を無菌採泥器により採取した．採取された底泥と殺菌処理した生プラ素材とを一緒にして，生プラ素材が唯一の炭素源となるような海水培地中に懸濁し，現場環境に近い圧力・温度条件にて，1次培養を開始した．図2図2■生プラ分解深海微生物の分離法に生プラ分解深海微生物の分離法の概略を示した．そして，最終的に生プラ素材のなかでも特にPolycaprolactone（PCL）を分解できる深海微生物の取得に成功した⁽^{2, 3)}2) T. Sekiguchi, T. Sato, M. Enoki, H. Kanehiro & C. Kato: J. Jpn. Soc. Extremophiles, 9, 25 (2010).3) T. Sekiguchi, T. Sato, M. Enoki, H. Kanehiro & C. Kato: JAMSTECR, 11, 33 (2010).．

図2■生プラ分解深海微生物の分離法

*DEEPBATH; 深海微生物実験システム．

得られた微生物は，好冷性の好圧菌でShewanella属，およびMoritella属に属しているバクテリアであった．ほかにも，中温性のPseudomonas属などのバクテリアも分離された．これらのバクテリアは，深海環境に広く分布している細菌類である．分離された深海微生物の各種生プラ素材の分解性スペクトル（表1表1■生プラ分解活性評価（プレート試験））を調べてみると，PCL以外の素材の分解性が確認されなかった．このことから深海環境では，生プラ素材の中でも分解できるものとできないものとが存在することがわかった．特に，私どもの日常生活では最もよく利用されている生プラ素材であるポリ乳酸（Polylactic acid; PLA）は，深海での分解性が厳しいことが示唆された．

表1■生プラ分解活性評価（プレート試験）
Bacteria	PCL	PBSA	PHB/V	PLA	同定種
Isolate #CT01	＋＋	—	—	—	S. benthica
Isolate #CT03	＋＋	—	—	—	S. benthica
Isolate #CT05	＋	NT	NT	NT	Moritella sp.
Isolate #CT06	＋	NT	NT	NT	Moritella sp.
Isolate #CT07	＋＋	NT	NT	NT	Shewanella sp.
Isolate #CT08	＋＋	—	—	—	M. abyssi
Isolate #CT12	＋＋＋	—	—	—	M. abyssi
Isolate #CT13	＋＋＋	NT	NT	NT	Moritella sp.
Isolate #JT01	＋＋＋	—	—	—	Moritella sp. nov.
Isolate #JT02	＋＋	NT	NT	NT	Moritella sp.
Isolate #JT04	＋＋＋	—	—	—	Moritella sp. nov.
Isolate #JT05	＋＋	NT	NT	NT	Psychrobacter sp.
Isolate #JT08	＋＋	NT	NT	NT	Pseudomonas sp.
S. benthica	±	—	—	—
M. abyssi	—	—	—	—
M. japonica	＋	—	—	—
条件は，4°C，大気圧（0.1 MPa）で1週間後判定．＋＋＋：5 mm以上，＋＋：2～5 mm, ＋：1～2 mm, ±: 1 mm以下，—：ハローなし，NT：Not tested. PCL：ポリカプロラクトン，PBSA：ポリブチレンサクシネートアジペート，PHB/V：ポリヒドロキシブチレート／バリレート，PLA：ポリ乳酸．

2. 微生物が生産する植物性バイオプラスチックPHBHを分解する深海微生物の探索

Copolymer of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate（PHBH）は，（株）カネカが開発した植物由来の新規の生プラ素材である（図3図3■PHBHの構造）．本素材は，遺伝子操作により微生物を使っての大量生産に成功し⁽⁴⁾4) S. Sato, H. Maruyama, T. Fujiki & K. Matsumoto: J. Biosci. Bioeng., 120, 246 (2015).，陸上環境での生分解性は確認されており，いくつもの商品開発がなされて既に市場に出回っている素材でもある．しかしながら，海洋環境，なかんずく深海環境での生分解性は不明のままであった．

図3■PHBHの構造

そこで，いくつかの深海調査で得られた水深1,000～4,000 mの深海底泥サンプルを材料にして，PHBH分解性深海微生物の探索を行った．その結果，α-,γ-Proteobacteria, Firmicutesに含まれる幅広いグループからPHBH分解菌が分離された（図4図4■PHBH分解菌の16S rRNA遺伝子系統樹）．分離株のなかでも特に低温にてPHBH分解活性の強かった4株（Alteromonas sp. strain MH-53, Reinheimera sp. strain PL-100, Psychrobacillus sp. strain PL-87, Bacillus sp. strain MH-10）を選び，加圧下での生育を調べたところ，MH-53株を除く3株において30 MPaまでに耐圧性を示し，50 MPaでも良好に生育することが確認され，耐圧性のバクテリアであることが明らかとなった．さらにこれらの株においては低温・加圧下でのPHBH分解活性も確認された⁽⁵⁾5) C. Kato, A. Honma, S. Sato, T. Okura, R. Fukuda & Y. Nogi: High Press. Res., 39, 248 (2019).．

図4■PHBH分解菌の16S rRNA遺伝子系統樹

□：特に低温で活性が強かった分離株．

深海微生物を利用した生プラ分解評価法

従来の生プラ分解評価法としては，①濁度測定法（パウダー化した生プラ素材の分解で溶液中の透明度が高くなる度合いを測定），②標準基質を用いた分光光学的な分解活性測定法（パラニトロフェノール基のついた基質を利用），③物理的な引張強度を測定する強度測定法，④赤外吸収スペクトル測定法（フーリエ変換赤外分光計（FTIR）にて，プラスチックの酸化分解度を測定する），⑤結晶化度測定法，などがある．しかしながら，これらの分解評価法に用いる装置では，深海特有の高水圧のかかった状態での測定は困難であった．そこで，高水圧がかかった状態で測定できる，生プラ分解評価法の開発を行ったので，ここで解説する．

1. 高圧連続培養システムの開発と生プラ分解性評価

これまで分離されたPCL分解活性をもつバクテリアのなかでも，相模湾水深1,000 mの底泥より分離された好気で耐圧性の深海微生物Pseudomonas sp. 18-2株を選び，この菌を使って高圧連続培養システムの開発を行った．図5図5■高圧連続培養システムの構築に本システムの構成を示す．

図5■高圧連続培養システムの構築

高圧連続培養システムは，恒常的な高水圧・低温環境を再現し，連続的に培地供給を行うことにより，より効率的に生プラ分解を定量できる点に特徴がある．本システムは，圧力調整バルブを介し，加圧容器（図5図5■高圧連続培養システムの構築②），液体クロマトグラフィー（HPLC）用のポンプ（図5図5■高圧連続培養システムの構築③）をラインでつなぎ，HPLC用ポンプに市販のエアーポンプにて除菌フィルターを介して酸素が供給された培地リザーバーから，培地が供給されるように組まれている．加圧容器の中には，滅菌された透析チューブ中に菌体とPCLシートが培地とともに入っており，連続的に供給される酸素の含まれた培地は，透析チューブを介してこの中に供給される仕組みとなっている．今回の実験条件としては，10 MPa, 5.5°Cで低温実験室内にて3週間連続培養を行い，15 mLの透析チューブ中にて菌体とPCLシートを接触させ，培養前後のPCLシートの乾燥重量を比較することにより分解性の評価を行った．同時に比較実験として，大気圧下での振とう培養，加圧下での静地培養も合わせ行った．その結果，高圧連続培養の系において，高圧静地培養の系と比較してたいへん良好な菌体の成育と，PCLシートの良好な分解活性が見られた（表2表2■高圧連続培養システムによるPCL分解評価）．培養処理後のPCLシート表面の走査型電子顕微鏡（SEM）においても，振とう培養時の結果と同様，シート表面に微生物による分解痕が明瞭に観察された．培養処理後の溶存酸素濃度の比較においても，連続系のほうが良好であったため，酸素供給による好気性深海微生物の活性化が，生プラ分解活性に直接的に相関していることが示された．しかしながら，この高圧連続培養法の実施においては完全に管理されたクリーンルーム中での作業が必要で，低温室に設置された通常のクリーンベンチの中では，長時間にわたる連続培養において空気中のバクテリアのコンタミのリスクが伴い，実験に高度なクリーン施設が必要という問題点が指摘されている．

表2■高圧連続培養システムによるPCL分解評価

2. フローサイトメトリーの利用による生プラ分解性の評価

一方，通性嫌気性のPCL分解菌である，日本海溝水深6,000 mの底泥より分離された好圧性Moritella sp. JT01の場合は，酸素供給がなくても十分生育できるので，従来の高圧静地培養法でもPCL分解活性が確認できるか，実験した．方法としては，①基質としてパウダー化したPCL粒子を用い，培地中に1％濃度で添加しJT01株を接種後，高圧静地培養（50 MPa, 4°C）を行う．②ほぼ3日おきにサンプリングし，直ちにDAPI（DNA染色剤）で菌体を選択的に染色する．③ベックマン社製のフローサイトメトリーを利用して，単位サンプル中に含まれるPCL粒子と菌体粒子の数を計測する．以上の3つのステップで行った．図6図6■フローサイトメトリーによるPCL分解評価に本評価法の結果を示す．

図6■フローサイトメトリーによるPCL分解評価

左上のドット：PCL粒子，右下のドット：DAPI染色されたJT01株菌体粒子．

培養当初は，PCL粒子（図6図6■フローサイトメトリーによるPCL分解評価左上）のみ検出されたのが，培養が進むにしたがって，バクテリア（JT01株）の数が増えてきて（図6図6■フローサイトメトリーによるPCL分解評価中上），1カ月後ではPCL粒子がほぼ分解されてバクテリアのみになってきた（図6図6■フローサイトメトリーによるPCL分解評価右）さまが，観測された．この方法は，整備された研究室ならどこにでもあるフローサイトメーターを利用できるという点で，汎用性があり前述の高圧連続培養システムを整備するよりは簡便であると考えられる⁽⁶⁾6) 兼廣春之，関口峻允，加藤千明，佐藤孝子：特許第5504440号　発明の名称「新規微生物，および該微生物を使用して生分解性プラスチックの生分解性を試験する方法」(2014).．

おわりに～SDGsに向けてのアクション～

これまで述べてきたように，新規の生分解性プラスチック素材を開発し人間生活に利用・応用するためには，その素材の陸上環境での分解性だけではなく，海洋環境，なかんずく恒常的な低温・高水圧下にさらされた深海環境での分解性の評価がたいへん重要である．プラごみが，最終的に蓄積されるのが深海底であることからも，こうした試験・評価の重要性は明らかである．その一方，最近，日本の微生物研究者らがペットボトルの処分場から，ペットの成分であるポリエチレンテレフタレート（PET）を分解できる微生物Ideonella sakaiensis 201-F6株の分離について報告した⁽⁷⁾7) S. Yoshida, K. Hiraga, T. Takehana, I. Taniguchi, H. Yamaji, Y. Maeda, K. Toyohara, K. Miyamoto, Y. Kimura & K. Oda: Science, 351, 1196 (2016).．PETはこれまで難分解性とされ，そのリサイクルや処分法についていろいろと議論されてきたプラスチック素材の一つであるが，基本はエステル結合で高分子化しているので，処分場の環境で適応していった微生物がエステル結合を分解する酵素，リパーゼやエステラーゼを進化させていったものと考えられる．こうした研究の進展を見ると，今後これまで使われてきたプラスチック素材を分解する新規の微生物の探索や，酵素工学や遺伝子改変などの手法により，より効率的にプラ素材を分解できる新規酵素の開発などが活発になっていくことも期待される．いずれにせよ，現状のプラごみ問題の克服のためには，新規の生分解性素材の開発・評価と，既存のプラ素材を処理できるバイオテクノロジーの進展が，車の両輪となって，進んでいくことが望まれる．

筆者は，2018年3月に国立研究開発法人海洋研究開発機構（JAMSTEC）での深海微生物研究者としての定年を迎え，同年4月より本格的に「NPO法人チームくじら号」の活動に専念するようになった．本法人の活動目的は，わが海洋立国日本において未来を担う子どもたちの科学離れに憂慮し，次世代へ引き継がれるべき海洋科学の普及が必要であるとの思いをもって，子どもたちへの海洋分野へ誘う教育啓発にある．具体的には，①深海ぼうけん絵本読み聞かせ隊活動（幼児～小学生向け）．②うみの環境しらべ隊活動（小学生高学年～中高生）の2本柱で行っている．②の活動では，実際に最寄りの海岸に出て，プラごみを拾いその量を測り，比重実験や顕微鏡観察などでその材質や由来を推定している．これらの活動では，常にSDGsの第14番目（海の環境）のゴールを意識して，活動に参加した子どもたちと「拾ったごみがどこから来るのか？」「今後どうすれば海の環境が改善されるのか？」などを，専門家を交えて考え学ぶ場を創出している．こうした一つひとつの活動はたいへん小さいものではあるが，参加した子どもたちの環境意識はますます高くなり，未来の科学者をめざす子ども達をこうした体験活動から育てていくという，たいへん重要な行動であると思っている．私どものこうした活動のうねりが海の環境問題の解決への進展にささやかでも貢献できれば，望外の喜びである．