さまざまな放線菌が創り出すST類縁化合物の化学構造

放線菌が生産する抗生物質ST（図1図1■STおよびST類縁化合物の化学構造）は，1943年にワックスマン博士によってStreptomyces lavendulaeの培養液から初めて単離され⁽¹⁾1) S. A. Waksman: J. Bacteriol., 46, 299 (1943).，以来，数多くの放線菌から見つかっている抗生物質である．STは，真核生物，原核生物の両者に対して強力な抗菌活性を示すにもかかわらず，ヒトなどの真核生物への毒性が強く医薬品や農薬として利用されていない．微生物由来の天然生理活性物質を探索する多くの研究者にとっては「有名な」化合物であり，STがもつ強力な抗菌活性を有効活用するために，有機化学的な手法による毒性緩和への努力が試みられ，多くの類縁化合物が創製されてきたが，実際に医薬品として利用された報告はない．このような背景の元，2006年に濱野らは，STのstreptolidine lactamを加水分解する新規微生物酵素SttHを見いだし，本酵素が触媒する修飾により，STの真核生物への強毒性を緩和することに成功した^{(2, 3)}2) Y. Hamano, N. Matsuura, M. Kitamura & H. Takagi: J. Biol. Chem., 281, 16842 (2006).3) C. Maruyama & Y. Hamano: Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 2494 (2009).（図2図2■新規ST加水分解酵素SttHによるSTの構造改変）．このことからSTの構造改変は，臨床応用などの実用化への可能性を有していることが示唆された．STおよびST類縁化合物は共通して，アミノ糖とアミノ酸誘導体からなるstreptothrisamine骨格（図1図1■STおよびST類縁化合物の化学構造）を有しているが，この化合物は各種微生物に対する抗菌活性も細胞毒性も示さない．しかしアミノ酸側鎖として，1～7残基のβ-lysine（β-Lys）またはβ-Lys oligopeptide［oligo（β-Lys）］⁽⁴⁾4) Z. Ji, M. Wang, J. Zhang, S. Wei & W. Wu: J. Antibiot. (Tokyo), 60, 739 (2007).，あるいはglycine誘導体が結合した，ST, BD-12，およびglycylthricinなどの多くの類縁化合物は強力な抗菌活性と細胞毒性を示す（図1図1■STおよびST類縁化合物の化学構造）．また，STにおいては，oligo（β-Lys）側鎖の長さが長くなればなるほど抗菌活性が強くなることから，ST類化合物の生理活性には，アミノ酸側鎖構造が重要な役割を果たしていると言える．さらに，前述したように，これまでに数多くのST類化合物が微生物から発見されているが，実はアミノ酸側鎖構造としては，β-Lysタイプとglycineタイプの2種類しか発見されていない．したがって，このアミノ酸側鎖部分にβ-Lysやglycine以外のアミノ酸を結合させることができれば，これまでにない新しいタイプのST類縁化合物を創製することができ，真核生物への毒性がなくなった化合物が創出できるのではないかと考えられた．そこで筆者らは，この生理活性に重要なアミノ酸側鎖構造の生合成機構に着目し，その仕組みを解明するとともに，応用利用によって新規ST類縁化合物の創製を行った．

図1■STおよびST類縁化合物の化学構造

図2■新規ST加水分解酵素SttHによるSTの構造改変

STが有するoligo（β-Lys）側鎖の生合成研究

放線菌Streptomyces rochei NBRC12908は，1～4残基のβ-Lysをアミノ酸側鎖に有するST（図1図1■STおよびST類縁化合物の化学構造）を生産する．一般的に放線菌における抗生物質の生合成遺伝子は，自己耐性遺伝子とクラスターを形成していることが知られていることから，ST自己耐性遺伝子（sttR）を指標に，ST生産放線菌S. rocheiゲノムライブラリーより，sttR遺伝子を含む約34 kbpのゲノム断片を有するコスミドを取得した．本コスミドの全塩基配列を決定したところ，sttR遺伝子近傍領域に非リボゾームペプチド合成酵素（NRPS）遺伝子を含む遺伝子群が見いだされ，STの生合成の一部は，NRPSが関与していると推測された．さらに，本コスミドを，STおよびST類縁化合物を全く生産しない異種放線菌Streptomyces lividansに導入した結果，その導入株はS. rocheiと同様に，β-Lys 3残基以上からなるoligo（β-Lys）を有するSTを生産した．したがって，本コスミドにはST生合成にかかわるすべての遺伝子群が含まれており，すなわちoligo（β-Lys）合成酵素遺伝子も含まれていることを明らかにした．そこで次に，得られた遺伝子群のなかから，oligo（β-Lys）合成酵素遺伝子の探索を行った．oligo（β-Lys）は非タンパク性アミノ酸であるβ-Lysが構成成分であること，また結合様式が通常のタンパク合成機構では考えられないイソペプチド結合であることから，遺伝子群に見いだされたNRPSはoligo（β-Lys）生合成に関与している可能性が強く示唆された．一般的なNRPSは，図3A図3■一般的なNRPSによるペプチド合成反応に示すように，ペプチド合成に必要なadenylation（A）domain, thiolation（T）domain, condensation（C）domainからなるモジュール構造を有し，さらに生成されるペプチド鎖長に一致する数のモジュール構造が連なった巨大タンパク質である．NRPSのA domainはそれぞれ基質特異性をもっており，A domainの触媒でアデニル化による活性化を受けた基質アミノ酸は，同じモジュール内のT domainに，補酵素4′-ホスホパンテテイン基を介したチオエステル結合でローディングされる．T domainにローディングされた隣り合わせたアミノ酸は，C domainの触媒によってペプチド結合が形成され，最終的に，TE domainと呼ばれるthioesterase domainによってNRPSからリリースされる（図3B図3■一般的なNRPSによるペプチド合成反応）．したがって，図3A図3■一般的なNRPSによるペプチド合成反応のような4つのモジュールから構成されるNRPSでは，テトラペプチドが生成され，生産されるペプチド鎖長は，NRPSのモジュール構造によって厳密に制御される．しかしながら，STが有するoligo（β-Lys）構造は，1～7残基と多様性があり，一般的なNRPSによる生合成機構にも当てはまらず，oligo（β-Lys）構造は新奇のNPRS反応機構によって生合成されると考えられた．そこで，本コスミドに含まれる各遺伝子の破壊実験による遺伝子工学的手法，各種生合成酵素を利用した生化学的な手法により，oligo（β-Lys）を次のように明らかにした⁽⁵⁾5) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M. Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano: Nat. Chem. Biol., 8, 791 (2012).（図4図4■STのoligo（β-Lys）側鎖構造の生合成機構）．ST生合成遺伝子群に含まれるNRPSであるOrf5, Orf18, Orf19のアミノ酸配列から，それぞれがもつdomain構造を調べたところ，Orf5とOrf19はA domainのみからなる単独型のA domainであり，またOrf18はT, C domainから構成されており，一般的なNRPSのようなモジュール構造をもたないことが判明した．次に，これら3つの酵素の組換え酵素を用いたin vitro反応の結果，A domainであるOrf5とOrf19は，両者ともβ-Lysをアデニル化によって活性化するが，Orf5によって活性化されたβ-LysだけがOrf18のT domainにローディングされることが明らかになった．さらに興味深いことに，Orf19によって活性化されたβ-Lysは，Orf18のT domainに結合した状態で進行するoligo（β-Lys）合成の伸長基質として直接使われ，そのペプチド合成反応は，Orf19が直接触媒するという極めて興味深いメカニズムであった．これまでにさまざまなNRPSのA domainが報告されているが，Orf19のように，基質の活性化だけでなく，それを直接基質として利用し，さらにペプチド結合を繰り返し合成できるA domainは初めての報告例であった．T domain上で伸長したoligo（β-Lys）は，Orf18のC domainの触媒によりST生合成中間体streptothrisamineと縮合し，STとしてOrf18からリリースされる（図4図4■STのoligo（β-Lys）側鎖構造の生合成機構）．すなわち，ST上のoligo（β-Lys）の鎖長は，どのタイミングでC domainがstreptothrisamineとoligo（β-Lys）の縮合を触媒するかで決まる．他方，T domain上でのoligo（β-Lys）の鎖長は，Orf19の触媒回数によって決まる．言い換えれば，Orf19の反応が早いか，あるいは，Orf18のC-domainの反応が早いかでSTのoligo（β-Lys）の鎖長が決まることが判明し，実際，C domainに部位特異的変異を導入し，活性を弱めた変異型酵素を用いて反応を行うと，C domainによるstreptothrisamineとoligo（β-Lys）の縮合のタイミングが遅れ，より長いoligo（β-Lys）鎖長を有するSTが生産された⁽⁵⁾5) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M. Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano: Nat. Chem. Biol., 8, 791 (2012).．

図3■一般的なNRPSによるペプチド合成反応

図4■STのoligo（β-Lys）側鎖構造の生合成機構

ST生合成酵素群を利用した新規ST類縁化合物の創製

Orf5とOrf19がβ-Lys以外に活性化するアミノ酸が存在するか，これらA domainの基質特異性を評価したところ，β-Lysの構造アナログであるβ-homolysine（β-hLys）も基質になることを明らかにした．そこで，基質としてβ-hLys, streptothrisamineを用い，3つの酵素Orf5, Orf18, Orf19にて酵素反応を行ったところ，streptothrisamineにβ-hLysが1～3残基結合した新規ST類縁化合物ST-hF, ST-hE, ST-hDが合成された⁽⁵⁾5) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M. Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano: Nat. Chem. Biol., 8, 791 (2012).．また，興味深いことに，β-Lysのみを基質とした酵素反応では，oligo（β-Lys）のみの構造を有するペプチド化合物が生成された．生成されたoligo（β-Lys）はSTの生合成に利用されることはなく，in vitro反応でのみ創製される新規ST類縁化合物であった．STのoligo（β-Lys）構造はSTの生理活性に重要な役割を有していることから，oligo（β-Lys）のみの構造が示す生理活性にはたいへん興味がもたれた．そこで，本研究で創製できた新規化合物のうち単離精製できた化合物についてその生理活性を評価した⁽⁵⁾5) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M. Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano: Nat. Chem. Biol., 8, 791 (2012).．その結果，streptothrisamineは，原核・真核細胞ともに全く活性を示さないことが判明し，ST-hFはST-Fと同程度に，原核・真核細胞に強い生理活性を示し，真核生物への毒性は緩和されていなかった．その一方で，6残基のβ-Lysからなるoligo（β-Lys）のみの構造においては，枯草菌Bacillus subtilisに対して特異的な抗菌活性を示し，医薬品のリード化合物としての可能性を見いだすことができた．

ST類縁化合物BD-12が有するglycine誘導体側鎖の生合成研究

BD-12⁽⁶⁾6) T. Furumai, K. Kaneko, N. Matsuzawa, M. Sato & T. Okuda: J. Antibiot. (Tokyo), 21, 283 (1968).は，STと同じく，streptothrisamine骨格を有することから，BD-12生合成遺伝子群にも，ST生合成遺伝子群に見いだしたstreptothrisamine生合成にかかわる遺伝子群が存在すると予想された．そこでBD-12生産菌S. luteocolor NBRC13826のBACライブラリーより，streptothrisamine生合成遺伝子群を指標にBD-12生合成遺伝子群を探索した．得られたBACクローンについて，BD-12を生産しない放線菌S. lividans TK23を宿主とした異種発現を試みたところ，BD-12の生産が確認されたことから，取得したBACクローンにはBD-12生合成にかかわるすべての遺伝子セットが含まれていることを明らかにした．われわれは，BD-12におけるglycine側鎖も，STのβ-Lys側鎖と同様，NRPSによって生合成されると予想し，BD-12生合成遺伝子群からOrf5, Orf18, Orf19のホモログ酵素遺伝子を探索したが，予想に反し，そのようなホモログ酵素遺伝子は存在していなかった．そこで，各遺伝子産物の構造予測を基にアミド合成にかかわる酵素遺伝子を探索した結果，Orf11がFemAX familyに相同性を示すことが判明した．FemAXは，微生物のペプチドグリカン生合成過程におけるペプチド架橋反応を触媒するtRNA依存型ペプチド合成酵素として知られている．したがってBD-12のglycine側鎖は，NRPSではなく，tRNA依存的なメカニズムで生合成される可能性が示唆された．

そこで次に筆者らは，Orf11の機能解析を行うために，Orf11組換え酵素を用いたin vitro反応を試みた．Orf11の基質となるaminoacyl-tRNAの供給には，大腸菌由来in vitroタンパク質合成システムを利用し，streptothrisamineとglycineを基質に酵素反応を行ったところ，BD-12生合成中間体glycylthricin（図1図1■STおよびST類縁化合物の化学構造）の生成が確認された⁽⁷⁾7) C. Maruyama, H. Niikura, M. Izumikawa, J. Hashimoto, K. Shin-ya, M. Komatsu, H. Ikeda, M. Kuroda, T. Sekizuka, J. Ishikawa et al.: Appl. Environ. Microbiol., 82, 3640 (2016).（図5図5■Glycylthricinのglycine側鎖の生合成機構）．また本反応について，先にRNaseにて前処理を行った後に酵素反応を行うとglycylthricinは生成されなかったことから，Orf11は確かにtRNA依存型アミド合成酵素であることを明らかにした．さらにOrf11の基質特性を調べるために，タンパク質性アミノ酸20種類を基質として用いて同様の酵素反応を行ったところ，興味深いことに，僅かにではあるがalanineを基質認識し，alanine側鎖を有する新規ST類縁化合物alanylthricinを生産することが判明した．前述したように，STおよびST類縁化合物のアミノ酸側鎖には，β-Lysタイプまたはglycineタイプの2種類しか見つかっていない．しかし，本酵素を用いた反応において，第3のアミノ酸側鎖をもつ新規ST類縁化合物の創製に成功した．すなわち，Orf11ホモログ酵素の探索とその応用利用は，さらなる新規ST類縁化合物の創出への可能性が期待された．

図5■Glycylthricinのglycine側鎖の生合成機構

Orf11ホモログ酵素遺伝子の探索と応用利用に関する研究

タンパク質翻訳システムにおいては，Gly-tRNA^Glyを含め20種のアミノアシル-tRNA^アミノ酸（aa-tRNA^aa）が存在することから，天然にはglycine以外のaa-tRNA^aaを基質認識するOrf11ホモログ酵素が存在すると考え，放線菌ゲノムデータベースより探索を行った．その結果，最近，Orf11ホモログ酵素Sba18を見いだし，Orf11と同様に機能解析を行ったところ，Sba18は，Gly-tRNA^Gly以外にもAla-tRNA^Ala，Ser-tRNA^Serを基質として認識し，glycylthricin, alanylthricinだけでなく，serineを側鎖にもつ新規ST類縁化合物serylthricinを生成することを明らかにした．Orf11とSba18は高い相同性（75％）を有するが，その基質特異性は大きく異なり，Sba18はaa-tRNA^aa分子におけるtRNA^aa構造，アミノアシル基構造の両者に対して，広い基質特異性を有するアミド合成酵素であることが判明した．

おわりに

Streptothrisamine骨格は，すべてのST類縁化合物の共通骨格であるが，本化合物は全く抗菌活性を示さない．しかしアミノ酸側鎖構造を有するSTやST類縁化合物のすべてが強力な抗菌活性を示すことから，これら化合物の生理活性には，アミノ酸側鎖構造が重要な役割を担っていると言える．したがってβ-Lysやglycine以外のアミノ酸側鎖をもつST類縁化合物の多様性創出は，真核生物に毒性を示さない有用化合物の創製につながると期待される．そこで本研究で新たに創製した3つの化合物，glycylthricin, alanylthricin, serylthricinについて，大腸菌，枯草菌，酵母に対する抗菌活性を評価した結果，残念ながら，いずれの化合物もSTやBD-12に比べて弱い抗菌活性が観察された．しかし興味深いことに，serylthricinについては，真核生物である酵母に対して全く抗菌活性を示さなかったことから，ST類縁化合物の医薬品リード化合物としての可能性を示唆できたと考えている．

本研究を通して，ST類縁化合物を生産する放線菌は，非タンパク質性アミノ酸（β-Lys）を構成成分とする場合にはNRPSを，タンパク質性アミノ酸（glycine）を利用する場合は，tRNA依存型ペプチド合成酵素を使い分けているような，微生物がもつ巧みな生合成戦略を実感した．今後も，われわれの想像を超えた巧妙な微生物酵素との出会いを楽しみに，新たな酵素の探索・活用を進めていきたい．そしていつか，われわれが必要とする生理活性をもつST類縁化合物をデザインし，論理的に生合成できることを目指していきたい．