・はじめに

日本農芸化学会の長い歴史のなかで一度だけ北陸（新潟）で大会が開催されたとき*¹のことである．奨励賞受賞講演の中で，大阪府立大学の林英雄（現同大学名誉教授）はオカラ培地で培養した糸状菌Penicillium simplicissimum AK-40株の産物の中から発見した殺虫活性物質オカラミン⁽¹⁾1) H. Hayashi, K. Takiuchi, S. Murao & M. Arai: Agric. Biol. Chem., 53, 461 (1989).について紹介した（図1図1■オカラミンAとB）．その場に居合わせた筆者の松田はオカラミンの構造に目を奪われると同時に，オカラを微生物の培地として使う研究にケーススタディとは思えない普遍的なものを感じた．これが，「今日の話題」の原点である．

図1■オカラミンAとB

・オカラミンの標的解明

オカラは食べ物という印象を受けるかもしれないが，その実は豆腐の製造で生じる廃棄物である．林によるとオカラは豆腐店から無料で入手したという．最小の研究費で最大の効果を生むということはこのことである．オカラミンの発見以降も林はオカラ培地にこだわり，糸状菌がつくるアスペルパラリン，コムネシン，クロドリマニンなどの昆虫活性物質を次々と手にした⁽²⁾2) H. Hayashi: Biosci. Biotechnol. Biochem., 79, 877 (2015).．

どの化合物も投与後早く活性を示すことから，それらの標的は神経系にあると推測した．その仮説を検証するためには，林が昆虫活性試験に用いたカイコガ幼虫の神経細胞ではたらくイオンチャネルの機能を測定可能なパッチクランプ測定技術が必須である．この手法を用いることで，アゴニストであればそれ自身が誘起するイオン電流の増大を，アンタゴニストであれば神経伝達物質などのアゴニストが誘起するイオン電流の抑制を指標として化合物の神経活性を定性・定量解析できるからだ．一見便利に見えるオートパッチクランプ装置が市販されているものの，それは比較的形が均一にそろっているcell lineでの実験に向いており，形がそろわない初代培養神経細胞での測定にはマニュアル型のパッチクランプ装置が適している．この手の実験には装置を購入しても結果が出るとは限らないリスクがある．実際，マニピュレータのドリフトを最小に抑制しても解決できない問題に遭遇した．それは，アゴニストを連続して細胞に処理すると電流応答が次第に減少して消失する“rundown”現象であった．1年以上データが取れない日々を過ごしてようやくこの問題を解決し，林がオカラ培地を用いて見つけた昆虫制御物質群（以降、林ライブラリと呼ぶ）における未解明問題の研究に着手した．スピロコハク酸イミド構造をもつアスペルパラリンはカイコガ幼虫に麻痺をひき起こす．本化合物の作用機構をパッチクランプ法で調べたところ，ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）に対して選択的にアンタゴニストとして作用した．しかも半数阻害濃度は数十nMと低濃度であるのに対して，試験した脊椎動物のnAChRに対して10 μMでもほとんど阻害作用を示さなかった．アスペルパラリンは昆虫選択的に作用する物質だった⁽³⁾3) K. Hirata, S. Kataoka, S. Furutani, H. Hayashi & K. Matsuda: PLoS One, 6, e18354 (2011).．ではオカラミンはどうかと思ったときには，冒頭の経験から20年以上の月日が過ぎようとしていた．

オカラミンのなかで最強の殺虫活性をもつのはオカラミンBである．本化合物をカイコガ脳神経細胞に処理するといきなり目の前にイオン電流の変化が現れた．この電流がゼロとなる膜電位，すなわち逆転電位を求めると，それはネルンストの式で与えられる塩素イオンの平衡電位とよく一致した．オカラミンは塩素チャネルを活性化しているらしい．昆虫の神経系で抑制性シナプス伝達を担う主要な塩素チャネルはγ-アミノ酪酸（GABA）作動性塩素チャネル（あるいはGABA受容体，GABACl）とグルタミン作動性塩素チャネル（GluCl）である．幸いどちらも遺伝子を保有し機能解析できる状態にあったので，すぐ実験に取りかかった．カイコガGABAClとGluClを別々にアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ，オカラミンBがどちらの塩素チャネルを活性化するのか調べたところ，オカラミンBと類縁体は濃度依存的にGluClだけを活性化し，その活性は殺虫活性と相関した．GluClは昆虫や線虫などの無脊椎動物でのみ発現するリガンド作動性塩素チャネルである（図2図2■オカラミンの標的グルタミン作動性塩素チャネル）．オカラミンはアスペルパラリンにも増して昆虫選択的であったことがわかった⁽⁴⁾4) S. Furutani, Y. Nakatani, Y. Miura, M. Ihara, K. Kai, H. Hayashi & K. Matsuda: Sci. Rep., 4, 6190 (2014).．その勢いで，林ライブラリの化合物クロドリマニンの標的についても調べたところ，GABAClに作用し，かつヒトのGABAClに比べておよそ1,000倍低い濃度で昆虫のGABAClを阻害することが明らかとなった⁽⁵⁾5) Y. Xu, S. Furutani, M. Ihara, Y. Ling, X. Yang, K. Kai, H. Hayashi & K. Matsuda: PLoS One, 10, e0122629 (2015).．

図2■オカラミンの標的グルタミン作動性塩素チャネル

上（左）と横（右）から見た図．

こうした偶然のレベルを超えた現象の連続を目にし，ダイズに限らず植物は一般的に共生微生物に指令を出し，それを受けた微生物は選択的に昆虫や線虫などの攻撃を抑止する物質をつくるという「根圏における植物の間接誘導防衛機構」を予想した⁽⁶⁾6) K. Matsuda: Curr. Opin. Insect Sci., 30, 67 (2018).（図3図3■植物根圏の間接誘導防衛機構）．これを検証するには，オカラミンなどの生産制御のしくみを明らかにすることが大切と考え，P. simplicissium AK-40株のオカラミンの生合成を解明すると同時に，オカラミンBの構造活性相関やGluCl内の結合部位も明らかにした⁽⁷⁾7) N. Kato, S. Furutani, J. Otaka, A. Noguchi, K. Kinugasa, K. Kai, H. Hayashi, M. Ihara, S. Takahashi, K. Matsuda et al.: ACS Chem. Biol., 13, 561 (2018).．そしてその先へと進む中で，本当に植物の根圏でオカラミンのような物質が昆虫の攻撃を抑制可能な濃度で蓄積されるのかと思っていたときのことである．別途，杉山，櫻井，藤井が加わりマメ科植物・ヘアリーベッチを栽培した土壌に含まれている物質を液体クロマトグラフィー（LC）-質量分析装置（MS）で解析し，対照区にはない特有のピーク群を発見した．

図3■植物根圏の間接誘導防衛機構

植物の化学シグナルにより指令を受けた微生物は植物を昆虫や線虫の攻撃から防ぐ物質を放出する．

・なぜ根圏土壌に含まれる二次代謝物の研究か

根圏とは「植物の根から影響を受ける土壌領域」のことである．根圏領域は植物の養分吸収のみならず，土壌中の生物とのインタラクションの場であることから，植物の生育に決定的に重要である．そのため，根圏を対象とした研究は世界的に盛んであり，特に近年，シーケンサー技術の発展に伴い根圏微生物叢を包括的に解析し，植物の健全な生育，作物生産に展開する研究の進展が目覚ましい⁽⁸⁾8) S. Compant, A. Samad, H. Faist & A. Sessitsch: J. Adv. Res., 19, 29 (2019).．

土壌で「植物が別の生物と相互作用する」という概念は広く受け入れられているものの，相互作用の実態である化合物については多くが未解明である．植物と土壌微生物の共生を開始するシグナルとして，フラボノイド（根粒共生）やストリゴラクトン（菌根共生）は有名であるが，筆者らは土壌中の含量が微量である，不安定である，解析手法が確立されていないなどの理由により，植物の生育，特に作物の持続的生産に重要な役割をもつ未解明の化合物が眠っていると考えていた⁽⁹⁾9) A. Sugiyama: J. Adv. Res., 19, 67 (2019).．そこで，筆者・杉山は「根圏ケミカルワールドの解明」と題し，これらの化合物を包括的に解明し，作物頑健性の向上を目指すCRESTプロジェクトを開始した．

・ヘアリーベッチのアレロパシー

ヘアリーベッチ（Vicia villosa）は，本来は欧米で使われていたマメ科牧草であり，明治末期に日本に導入された優秀な緑肥である．第二次世界大戦後の昭和20年代の食糧難の頃に緑肥としての利用が四国農業試験場で研究され，コモンベッチとともにエンバクと混植する農法が一時流行した⁽¹⁰⁾10) 江原　薫：“飼料作物学”，上巻，養賢堂，1960, p. 389.．その後化学肥料と農薬の普及で利用は下火になったが，1990年ころにアレロパシー活性が強く雑草抑制能が高いことが見いだされた⁽¹¹⁾11) 藤井義晴：農業技術，50, 199 (1995).．その後本種は，稲作に利用可能であることが示された⁽¹²⁾12) 堀元栄枝，荒木　肇，伊藤一幸，藤井義晴：雑草研究，47, 168 (2002).．

ヘアリーベッチのアレロケミカルについては，精製途中で成分が消えてしまう困難に遭い，同定に10年を要したが，加茂らによって活性本体の一つとしてシアナミドが単離された⁽¹³⁾13) T. Kamo, S. Hiradate & Y. Fujii: J. Chem. Ecol., 29, 275 (2003).．シアナミドは合成窒素肥料として100年以上前に合成された石灰窒素の成分であるが，天然物として生物界から単離されたのはこれが最初であった．その後，ヘアリーベッチを用いた実用的な栽培技術が開発され，現在では北海道，新潟県，富山県，滋賀県，兵庫県などの稲作専業農家や愛媛，神奈川の果樹農家で使用されている⁽¹⁴⁾14) Y. Fujii & K. S. Appiah: “Allelopathy for Sustainable Weed Management,” CRC Press, 2019, p.166.．特に，神奈川県のキウイフルーツ栽培農家でヘアリーベッチを10年以上下草として連作すると潰瘍病（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）が発生せず，病害虫の発生が顕著に減少することや，愛媛県今治市のミカン栽培専業農家で本種を16年連作すると病害虫の被害を受けないことが見いだされた．さらに，茨城県農業総合センターの病虫研究室でバレイショやインゲンの栽培にヘアリーベッチを連作するとじゃがいもそうか病（Streptomyces acidiscabies, S. scabies, S. turgidiscabies），かぼちゃ立ち枯れ病（Fusarium oxysporum, F. solani），ベニバナインゲン茎根腐れ病（Pythium myriotylum）が顕著に抑制されることも観察された．そして近年，ダイズ栽培専業農家でヘアリーベッチをダイズの前作として秋に播種し，翌年夏にダイズを栽培すると，収量が増し，特に秀品率が向上することがわかると，兵庫県と京都府北部の黒大豆農家で本種が利用されるようになった．

これらの現象は，シアナミドでは説明がつかない．シアナミドは土壌中では1～2週間で尿素を経てアンモニア態窒素に変換され，やがて硝酸態窒素となってすべてが植物に養分として吸収され，殺虫・殺菌効果が長続きしないからである．きっと，根圏環境に未知のアレロケミカルが存在するに違いない．この動機が，根圏ケミカルワールドプロジェクトを進展させる起爆力となった．

・ノンターゲットメタボロームの最新技術を駆使してヘアリーベッチ栽培土壌の未知の物質を解く

根圏ケミカルワールドの実態を解き明かすために最初に行ったことは，土壌にはどれだけの成分的な違いがあるのかという基礎情報を得ることだった．そこで，参画者が所持していた5種類の土壌サンプルをもち寄り，LC-MSによるメタボローム解析を試みた．どの土壌でも，検出された成分は数百程度であり，数千成分に及ぶこともある植物体に比べて，圧倒的に数が少なかった．それに加えて，土壌間で構成成分が大きく異なっていることがわかった．なかでも目を引いたのは，ヘアリーベッチを栽培した後の土壌で，主成分分析では，植物を栽培していないほかの土壌と顕著に異なっていた．そこで，その違いに寄与している成分をリストアップし，計測された質量値から，既存の化合物データベースに検索をしてみると，多くのものが窒素を含む成分の可能性があることがわかった．これは何か意味があるかもしれない．リストのなかにある，オカラミンという，風変わりな名前に目が留まった．調べてみると，林が1989年に発見した殺虫活性物質で，松田らが昆虫内の標的や生合成を解明したという⁽⁴⁾4) S. Furutani, Y. Nakatani, Y. Miura, M. Ihara, K. Kai, H. Hayashi & K. Matsuda: Sci. Rep., 4, 6190 (2014).．ヘアリーベッチを栽培後の土壌で見つかったことで，アレロパシーに関与する可能があれば興味深い．化合物の部分構造の質量を計測できるMS/MS解析のデータからは，オカラミンの化学構造と矛盾しないデータが得られている．さらに，筆者らが作った食品のメタボローム解析データベースには，同じ質量値の成分がどの食品からも検出されておらず，土壌特異的に存在する成分の可能性が高まった．そこで，筆者全員が集まり意志を統一．早速LCの溶出時間やMS/MSデータを標品と比較したところ，ヘアリーベッチを栽培した土壌にオカラミンA, B, Cが存在することを確認できた．さらなる調査では，①圃場で栽培したヘアリーベッチの根圏にオカラミンBが存在すること，②ヘアリーベッチを栽培し，後作として植えたダイズの根圏でもオカラミンBが検出されたこと，③その濃度は殺虫活性が見られるのと同程度であったこと，④ヘアリーベッチを栽培しなかった畑のダイズ根圏ではオカラミンBは検出されなかった．以上のことから，ヘアリーベッチとの相互作用で共生糸状菌P. simplicissimumがオカラミンを生合成し，それが後作のダイズ根圏でのオカラミン生産にも影響を与えることが示唆された⁽¹⁵⁾15) N. Sakurai, H. M. Korrani, M. Nakayasu, K. Matsuda, K. Ochiai, M. Kobayashi, Y. Tahara, T. Onodera, Y. Aoki, T. Motobayashi et al.: Front. Genet., in press.．ヘアリーベッチの緑肥としての効果には，おそらく共生微生物による昆虫忌避という間接誘導防衛システムが機能していると推察された．

本研究で行ったメタボローム解析では，僅か6試料（土壌5＋コントロール1）のLC-MS解析データからオカラミンの同定という最大限の成果を得ることに成功したが，これは多くの幸運に支えられている．①土壌中の成分数は少ないものの，その構成が多様性に富んでいたことにより，解析対象を効率よく絞り込むことができた．また，②オカラミンには分子量の異なる複数の分子種があり，候補リストのなかでそれらが何度も登場していたことで，数ある候補成分のなかから，オカラミンに着目することができた．そして最も大きかったことは，③オカラミンが日本人により発見され，その後の研究が継続され，標品がすぐ入手できたことである．特に②と③は，日本の天然有機化学の蓄積がもつ大きなアドバンテージであり，メタボローム解析と非常に相性の良い条件が整っていたと言える．

・未来に向けて

ヘアリーベッチを栽培した土壌では根圏微生物叢が変化し，オカラミンを生合成する菌が増加して，土壌および植物体中でオカラミンのような生理活性物質が蓄積し，後作として栽培した植物の病害虫防除に貢献している可能性が極めて高い．このような現象を利用することにより，根圏環境を健全なものとし，栽培土壌を頑健なものにすることができると考えられる．ここに記した現象は「氷山の一角」に過ぎない．このような根圏環境は，森林や自然植生下で多種の植物—微生物が共生している現象を再現している．今回の発見は，同時期に存在する植物—微生物間の化学物質を介したコミュニケーションではなく，ヘアリーベッチが土壌に残したオカラミンやオカラミン生合成能力を有する微生物が次に作付けされたダイズの根圏で機能するという，時を経て受け継がれる種間の相互作用である．すなわち，オカラミンが「遺産」としてヘアリーベッチからダイズに受け継がれ，ダイズの生育に有利な環境をつくっていたのだ．この生命共生環境は，気象変動や災害などによって不安定化する農業生態系を安定化させ，農薬や化学肥料の使用を抑制しつつ，作物の質を安定化させる「頑健性制御」に役立つはずである．

今回発見した現象は，農薬や化学肥料の革新にもつながる．技術の粋を尽くして標的を広げ活性の検出感度を上げると，超高感度の望遠鏡を使うことによってそれまで見えなかった宇宙の広がりが見えるのと同様に，無限の間接誘導防衛現象が見えてくるに違いない．そこから生まれてくる化合物は，対象と非対象の区別という課題⁽¹⁶⁾16) K. Matsuda, M. Ihara & D. B. Sattelle: Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 60, 241 (2020).を解決し，未来の農業に道をひらくと期待される．

・最後に

本稿の起源オカラミンの発見者である林は，その後テーマを菌根共生にかかわるストリゴラクトンやクオーラムセンシングにかかわるホモセリンラクトンにまで広げ，研究を進めた⁽²⁾2) H. Hayashi: Biosci. Biotechnol. Biochem., 79, 877 (2015).．それは，共生にかかわる天然物化学がしたかったからだという．そうではない．林は最初から共生の化学について研究していたのである．

本記事は「微生物を介した植物の間接誘導防衛機構の解明にもとづく次世代昆虫制御物質の創出」（科学研究費補助金，代表：松田一彦）と「根圏ケミカルワールドの解明と作物頑健性制御への応用」（CREST，代表：杉山暁史）により支援を受けた成果である．