タンパク質分解による発現量制御

これまでタンパク質機能を解析するために，標的タンパク質を除去して何が起こるかを調べるということは多くの研究において行われてきた．一番わかりやすい例は，遺伝子ノックアウト体の解析である．しかしながら，細胞機能に重要な遺伝子はノックアウトできないこともあるうえに，ノックアウト体は遺伝子機能の欠損に対して，適応が起きている懸念もある．このような問題を避けるためには，必要なときに標的タンパク質の発現量を抑制すればよい．このようなケースに汎用される技術はCre-loxPを利用したコンディショナルノックアウトやRNA干渉によるmRNA除去である（図1A図1■コンディショナル発現量制御法）．これら技術はDNAもしくはRNAレベルで機能するため，すでに合成された標的タンパク質はその半減期に依存して減少する．そのため，一般にこれら技術を用いて標的タンパク質が減少し表現型解析が可能になるまでには，2～3日の時間を要する．この時間の間，標的タンパク質は減少を続けながら，細胞は増殖を続けることになり，その間に予期せぬ二次的影響が表現型に現れる懸念もある．

図1■コンディショナル発現量制御法

（A）セントラルドグマの各過程におけるコンディショナル発現量制御法．標的タンパク質分解薬とデグロン技術はタンパク質レベルで作用するため，作用速度が速い．（B）ユビキチン－プロテアソーム系．タンパク質はE3ユビキチンリガーゼに認識されると，ポリユビキチン化を受けて，プロテアソームにより分解される．化合物によりタンパク質とE3ユビキチンリガーゼの結合を操作できれば，タンパク質を自由に分解除去できる．

このような懸念を回避するには，標的タンパク質を迅速に除去し，その表現型を観察すれば良い．細胞にはタンパク質をユビキチン化して，プロテアソームによる分解に導く，ユビキチン－プロテアソーム分解系が存在する⁽¹⁾1) T. Ravid & M. Hochstrasser: Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 679 (2008).（図1B図1■コンディショナル発現量制御法）．この分解系は，数分程度の短時間で機能し，非常に分解除去効率が高い．ユビキチン－プロテアソーム分解系において，重要な機能を果たすのがE3ユビキチンリガーゼと呼ばれる一群の酵素である⁽²⁾2) M. D. Petroski & R. J. Deshaies: Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, 9 (2005).．これらE3ユビキチンリガーゼと標的タンパク質の認識を，低分子化合物により制御することができれば，迅速に標的タンパク質を分解除去することが可能になる．このような技術が以下に説明する，標的タンパク質分解誘導薬やデグロン技術である（図1A図1■コンディショナル発現量制御法）．

標的タンパク質分解誘導薬

標的タンパク質分解薬はproteolysis targeting chimera（PROTAC），specific and nongenetic IAP-dependent protein eraser（SNIPER）などと呼ばれる化合物の総称である^{(3, 4)}3) M. Toure & C. M. Crews: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 55, 1966 (2016).4) M. Naito, N. Ohoka, N. Shibata & Y. Tsukumo: Front Chem., 7, 849 (2019).．これら化合物は，E3ユビキチンリガーゼに結合する化合物と，標的タンパク質に結合する化合物を，リンカーで結合したキメラ化合物である（図2A図2■低分子化合物による標的タンパク質とE3ユビキチンリガーゼの結合）．そのため，標的タンパク質分解薬がE3ユビキチンリガーゼと標的タンパク質を近接させることで，標的タンパク質のユビキチン化を引き起こし，プロテアソームによる分解へ導く．当初はE3ユビキチンリガーゼ結合部位としてペプチド配列を使っていたため，分子量が大きく膜透過性もよくなかった．しかし，E3ユビキチンリガーゼを構成するMDM2, clAP, CRBN（セレブロン），VHLに結合する低分子化合物が相次いで同定され，これらが標的タンパク質分解薬の材料として利用されている^{(3, 4)}3) M. Toure & C. M. Crews: Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 55, 1966 (2016).4) M. Naito, N. Ohoka, N. Shibata & Y. Tsukumo: Front Chem., 7, 849 (2019).．たとえば，E3ユビキチンリガーゼCUL4A–CRBNを構成するCRBNにはサリドマイド化合物が結合することが知られている⁽⁵⁾5) T. Ito, H. Ando, T. Suzuki, T. Ogura, K. Hotta, Y. Imamura, Y. Yamaguchi & H. Handa: Science, 327, 1345 (2010).．そこで，標的タンパク質ブロモドメインタンパク質BRD4に結合する化合物JQ1を利用してキメラ化合物が作成された．これらキメラ化合物は腫瘍細胞増殖にかかわるBRD4を分解除去することから，抗腫瘍薬として期待されている^{(6, 7)}6) J. Lu, Y. Qian, M. Altieri, H. Dong, J. Wang, K. Raina, J. Hines, J. D. Winkler, A. P. Crew, K. Coleman et al.: Chem. Biol., 22, 755 (2015).7) G. E. Winter, D. L. Buckley, J. Paulk, J. M. Roberts, A. Souza, S. Dhe-Paganon & J. E. Bradner: Science, 348, 1376 (2015).．標的タンパク質分解薬は，基礎生命科学におけるタンパク質機能解析よりは，むしろ新たな創薬としての可能性が注目されている．従来から酵素や受容体の阻害剤としての薬が開発されてきたが，この方法では触媒活性や結合活性を示さない多くのタンパク質に対して薬を作成することができない．標的タンパク質分解薬はこれまでない新しいタイプの薬になることが期待されている．

図2■低分子化合物による標的タンパク質とE3ユビキチンリガーゼの結合

（A）標的タンパク質分解誘導薬の作用模式図．標的タンパク質分解誘導薬は2つの結合部位をもつキメラ化合物で，標的タンパク質とE3ユビキチンリガーゼを近接させる作用をもつ．（B）デグロン技術の作用機序．標的タンパク質にデグロンを付加することにより，特定のリガンドで結合性を操作できる．

デグロン技術

標的タンパク質分解誘導薬は，標的タンパク質に対して一つ一つテーラーメードで分解誘導薬を作成する必要があり，基礎生命科学のタンパク質機能解析研究で使うにはあまり実用的ではない．より一般性の高いのは，化合物により分解を誘導できるタグ（デグロンと呼ぶ）を利用することである⁽⁸⁾8) T. Natsume & M. T. Kanemaki: Annu. Rev. Genet., 51, 83 (2017).（図2B図2■低分子化合物による標的タンパク質とE3ユビキチンリガーゼの結合）．この方法にも大きく分けて，標的タンパク質分解誘導薬を応用した方法とそれ以外の方法に分けることが可能である．

標的タンパク質分解誘導薬を応用した方法として，一番よく知られている例はdTAG法であろう⁽⁹⁾9) B. Nabet, J. M. Roberts, D. L. Buckley, J. Paulk, S. Dastjerdi, A. Yang, A. L. Leggett, M. A. Erb, M. A. Lawlor, A. Souza et al.: Nat. Chem. Biol., 14, 431 (2018).．FKBP12タンパク質の変異体FKBP12（F36V）はラパマイシンアナログAP1867に結合する．そこで，サリドマイド化合物とAP1867をリンカーでつないだ標的タンパク質分解誘導薬dTAG-13が合成された（図3A図3■2つのデグロン技術の作用機序）．FKBP12（F36V）をデグロンとして，標的タンパク質のNもしくはC末端に融合させると，融合標的タンパク質はdTAG-13存在下において，E3ユビキチンリガーゼCUL4A–CRBNに呼び込まれて分解に導かれる（図3A図3■2つのデグロン技術の作用機序）．この方法は，すでにタンパク機能解析に利用された報告がある^(10～12)10) H. T. Huang, H. S. Seo, T. Zhang, Y. Wang, B. Jiang, Q. Li, D. L. Buckley, B. Nabet, J. M. Roberts, J. Paulk et al.: eLife, 6, (2017).12) L. Brunetti, M. C. Gundry, D. Sorcini, A. G. Guzman, Y. H. Huang, R. Ramabadran, I. Gionfriddo, F. Mezzasoma, F. Milano, B. Nabet et al.: Cancer Cell, 34, 499 (2018).．類似の技術として，HaloTagとE3ユビキチンリガーゼCUL2–VHLを近接させる標的タンパク質分解誘導薬を利用して，HaloTagをデグロンとして機能させるHaloPROTAC法も報告されている⁽¹³⁾13) D. L. Buckley, K. Raina, N. Darricarrere, J. Hines, J. L. Gustafson, I. E. Smith, A. H. Miah, J. D. Harling & C. M. Crews: ACS Chem. Biol., 10, 1831 (2015).．

標的タンパク質分解誘導薬とは異なる原理で作動するデグロン技術として，私たちが開発したオーキシンデグロン（auxin-inducible degron; AID）技術がある⁽¹⁴⁾14) K. Nishimura, T. Fukagawa, H. Takisawa, T. Kakimoto & M. Kanemaki: Nat. Methods, 6, 917 (2009).（図3B図3■2つのデグロン技術の作用機序）．植物は植物ホルモンオーキシンにより活性化される，他の真核細胞がもたないユニークなタンパク質分解系が存在する⁽¹⁵⁾15) K. Mockaitis & M. Estelle: Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 24, 55 (2008).．転写抑制因子AUX/IAAファミリータンパク質は，転写因子ARFと結合して遺伝子発現を抑制しているが，オーキシン存在下ではAUX/IAAが分解されて転写抑制が解除される．この分解反応は，E3ユビキチンリガーゼSCF–TIR1複合体を構成するTIR1オーキシン受容体が，オーキシン依存的に，AUX/IAAと結合することで始まる．私たちはE3ユビキチンリガーゼSCFを構成するサブユニットはすべての真核生物に高度に保存されていることに注目し，TIR1受容体を酵母やヒト細胞に導入することで，これら細胞中でSCF–TIR1複合体を再構成できることを見いだした．この条件下において，AUX/IAAの一つから見いだしたデグロンであるmini-AID配列（mAID）を標的タンパク質のNもしくはC末端に付加することで，オーキシン（天然オーキシンIAAもしくは人工オーキシンNAA）存在下でデグロン付加タンパク質を分解除去することができる（図3B図3■2つのデグロン技術の作用機序）．

図3■2つのデグロン技術の作用機序

（A）dTAG技術の作用機序模式図．dTAG-13は標的タンパク質分解誘導薬の一種で，FKBP12（F36V）とCUL4–CRBN複合体の結合を引き起こす．（B）オーキシンデグロン技術の作用機序．対象となる細胞にTIR1遺伝子を導入することにより，内在性のサブユニットを利用してSCF–TIR1複合体を再構成させる．この条件下で標的タンパク質にmAIDを付加すると，オーキシン依存的にmAID付加タンパク質が認識されて分解される．

オーキシンデグロン技術によるタンパク質分解除去

2009年にオーキシンデグロン法を開発した当初は，ゲノム改変操作の容易さから出芽酵母における利用が中心的であった．ところが，2013年にCRISPR–Cas9法により，ゲノム改変が培養細胞においても一般的になり，大きく状況が変わった．私たちは，まずヒト培養細胞HCT116を材料として，ヒトゲノムにおいてヘテロクロマチンによる不活性化を受けにくいとされるAAVS1領域に，CRISPR–Cas9利用してTIR1を挿入した親細胞を樹立した（図4A図4■オーキシンデグロン技術によるヒト変異細胞の作成）．さらに，この親細胞の内在性遺伝子をCRISPR–Cas9により改変して，mAIDデグロン配列を挿入したヒト変異細胞を作成することに成功した⁽¹⁶⁾16) T. Natsume, T. Kiyomitsu, Y. Saga & M. T. Kanemaki: Cell Rep., 15, 210 (2016).．

図4■オーキシンデグロン技術によるヒト変異細胞の作成

（A）ヒト変異細胞作成法．細胞内にTIR1遺伝子を導入し，SCF–TIR1複合体が発現する親細胞を作成する．この細胞をさらに，CRISPR–Cas9ゲノム編集を利用して，内在性の標的遺伝子にmAIDタグを導入する．（B）コヒーシンサブユニットRAD21を用いた例．TIR1を発現するHCT116細胞を材料に，内在性RAD21にmAID–Cloverを導入した．天然オーキシンIAA添加後，核内のRAD21発現量が速やかに減少している．（C）Bで示したデータを定量化してグラフにした．

一例として，姉妹染色体接合や染色体高次構造形成に重要な機能を担うコヒーシンのRAD21サブユニットに対するオーキシンデグロン変異株を作成した例を紹介する（図4B図4■オーキシンデグロン技術によるヒト変異細胞の作成）．上記で述べた方法により，内在性RAD21のC末端ににmAID–mCloverタグ（mCloverは蛍光タンパク質）を挿入した株を作成した．RAD21–mAID–mCloverが核内に局在している様子がみえるが，天然オーキシンIAAの添加により速やかに消失している様子が観察できる（図4B図4■オーキシンデグロン技術によるヒト変異細胞の作成）．この蛍光シグナルを定量してグラフにしたところ，IAA添加後の半減期は20分程度であった（図4C図4■オーキシンデグロン技術によるヒト変異細胞の作成）．標的タンパク質の発現量にも依存するが，オーキシンデグロン法を利用することにより，一般的に半減期15～45分程度で標的タンパク質を分解除去することができる．本技術はすでに多くの研究報告で実際のタンパク質機能解析に利用されており，酵母や培養細胞だけでなく，線虫，ショウジョウバエ，ゼブラフィッシュにおける応用も報告されている⁽⁸⁾8) T. Natsume & M. T. Kanemaki: Annu. Rev. Genet., 51, 83 (2017).．分解速度の速さと効率の高さから，世界中の研究現場においてオーキシンデグロン法が利用されるようになってきている．

今後のオーキシンデグロン技術の課題は，大きく分けて3つある．まず第一番目の問題点として，標的タンパク質に付加したmAIDデグロンがオーキシン非存在下においてもTIR1に弱く結合するため，わずかではあるが標的タンパク質が常に分解を受ける問題がある⁽¹⁶⁾16) T. Natsume, T. Kiyomitsu, Y. Saga & M. T. Kanemaki: Cell Rep., 15, 210 (2016).．第二番目の問題点は，分解誘導に利用するIAAもしくはNAAは100～500 µMと比較的高濃度であることである．培養細胞で短時間の処理においては，大きな問題を引き起こさないが，長期的には細胞増殖に多少の影響を与える．また，幹細胞などより感受性の高い細胞を利用する際には，処理濃度の高さは問題になる可能性がある．第三番目の問題点は，オーキシンデグロン法のマウス個体における利用にはどこも成功していないことである．また，IAAは肝臓で代謝されてインドキシル硫酸に変化することが知られており，これが腎毒性を引き起こすことが知られている．今後，マウスへの応用を考えた際に，現在のオーキシンデグロン法のままでは問題が起きる可能性がある．これらの問題点を踏まえて，今後さらなるオーキシンデグロン技術の改良が望まれている．

今後の見通し

化合物によるタンパク質分解制御の歴史は，まだ15年程度と比較的まだ若い分野と言って良い．標的タンパク質分解薬に関しては，今後より多くのE3ユビキチンリガーゼに結合する新規化合物が同定されて，それらを利用してさまざまな標的タンパク質分解薬が作成されるようになるだろう．同時に標的タンパク質分解薬の臨床における試験も進み，いずれ新薬として登場することが期待される．全く新しいクラスの薬になるため，大きな創薬の潮流になる可能性を秘めている．

デグロン技術に関しては，新たなシステムが登場してくることも期待される．特に植物にはまだほかにタンパク質分解を誘導する植物ホルモンが知られており，これらを応用することが可能かもしれない．オーキシンデグロン技術に関しては，より汎用性を高めた改良が期待される．