はじめに～イナワラは前処理なしでは糖化しにくい基質である～

食品の国際規格であるCodex委員会により，食品中のカドミウムやヒ素などの国際基準値が設定され，食品安全法により1 kgの精米中のカドミウム上限値は0.4 mgという数値が設定された．日本に数多く存在するカドミウム含有土壌に対してとられている対策としては，水稲の間断灌漑栽培による低吸収化や，「コシヒカリ環1号」のようなカドミウムが低吸収で玄米に蓄積しないイネ⁽¹⁾1) S. Ishikawa, Y. Ishimaru, M. Igura, M. Kuramata, T. Abe, T. Senoura, Y. Hase, T. Arao, N. K. Nishizawa & H. Nakanishi: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 19166 (2012).を栽培する方法のほか，「ファイレメCD2号」のようなカドミウム高吸収性のイネに重金属を吸収させたうえで収穫し，土壌を浄化するファイトレメディエーションを実施する方法⁽²⁾2) 農林水産省：“国立研究開発法人 農業・食品技術総合研究機構 農業環境変動研究センター，植物による土壌のカドミウム浄化技術 確立実証事業実施の手引（第2版）”, 2018.が考えられている．しかし現状は，ファイトレメディエーション後のカドミウム含有収穫物（草本系のバイオマス）は，産業廃棄物として焼却処分されるため，この間，農家収益にはつながらない．もしこれらがバイオエタノールの原料として有効利用されるなら，買い上げが可能となりファイトレメディエーションの推進が容易となると考えられる（図1図1■高カドミウム吸収性イネを用いたファイトレメディエーションの様式）．また，こうしたイナワラに限らず，カドミウム含有土壌で栽培されたイナワラには多寡の差はあってもカドミウムを含有しており，水田への鋤込みは土壌にカドミウムを戻すことになるため，水田からもち出してバイオマス資源として利用するのがよいと考える．

図1■高カドミウム吸収性イネを用いたファイトレメディエーションの様式

一般に，イナワラからバイオエタノールを生産するには，粉砕したイナワラはヘミセルロースの低分子化やリグニンの除去，セルロースの結晶性を下げセルロースを多孔性にして酵素との接近性を高めるなどの前処理を施した後，セルロースを酵素糖化し，生成したグルコースをアルコール発酵する方法が採られる⁽³⁾3) P. Binod, R. Sindhu, R. R. Singhania, S. Vikram, L. Devi, S. Nagalakshmi, N. Kurien, R. K. Sukumaran & A. Pandey: Bioresour. Technol., 101, 4767 (2010).．現在，糖化酵素としてよく使用されているのはTrichoderma属の微生物から生成されたセルラーゼで，結晶セルロースを分解することができる⁽⁴⁾4) 森川　康：“次世代バイオエタノール生産の技術革新と事業”，株式会社フロンティア，2010, pp. 295–302.が，この酵素を使用してもイナワラは前処理なしでは糖化が難しい⁽⁵⁾5) F. Ghorbani, M. Karimi, D. Biria, H. R. Kariminia & A. Jeihanipour: Biochem. Eng. J., 101, 77 (2015).．しかし，前処理としてリグニン除去処理をした場合，発生するアルカリ廃液の処理など環境への負荷などやコスト面で問題がある．さらに，イナワラにはケイ素が高濃度で存在しており^{(3, 6)}3) P. Binod, R. Sindhu, R. R. Singhania, S. Vikram, L. Devi, S. Nagalakshmi, N. Kurien, R. K. Sukumaran & A. Pandey: Bioresour. Technol., 101, 4767 (2010).6) S. Jin & H. Chen: Process Biochem., 41, 1261 (2006).，糖化の過程で可溶化したケイ素がポリマーを形成し，酵素反応を妨害する可能性がある．そこで本研究では，イナワラをこうした前処理をしなくても糖化できる酵素の探索を試みている．

イナワラを食べて生きる昆虫はイナワラ糖化酵素をもっているに違いない

イナゴなどイネ科害虫とされている昆虫は，高ケイ素含有バイオマスであるイネを食べて生きている．つまりこれらの昆虫は効率よくイナワラをエネルギーに変える術をもっているはずである．そこで，われわれはイネ科植物を食草とする昆虫の腸に着目し，イナワラを高効率で分解する糖化酵素を得ることを目的に，イナワラの組成であるセルロースとヘミセルロースを効率よく糖化する酵素，あるいは糖化条件の探索，さらに昆虫の腸内に存在する糖化酵素としてのタンパク質と昆虫腸内に共生する微生物の分泌酵素の解析を行った．

まず，主にイネを食草としている昆虫としてイナゴ（Oxya japonica），ショウリョウバッタ（Acrida cinerea），ニカメイチュウ（ニカメイガ）（Chilo suppressalis）に注目した．イナワラ糖化能はイネを食害する生育ステージで一番高いと考え，イナゴ，ショウリョウバッタは成虫の，ニカメイチュウは幼虫の腸内粗酵素を抽出し，CMC（carboxymethyl cellulose）の糖化能を調べた．結果としてイナゴ，ショウリョウバッタには還元糖の生成が見られたが，ニカメイチュウでは還元糖はほとんど検出できなかった．特にイナゴは，同じバッタ目のショウリョウバッタの約2倍のCMCを分解することが示された（図2図2■イネ害虫腸内酵素のCMC糖化能）．Oppertら⁽⁷⁾7) C. Oppert, W. E. Klingeman, J. D. Willis, B. Oppert & J. L. Jurat-Fuentes: Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 155, 145 (2010).は，8目36科68種にわたる昆虫のCMC糖化能を比較しているが，そのなかでもコウチュウ目，シロアリ目，バッタ目の活性が高いことを示しており，この結果を裏付けている．しかし，CMCは水溶性のセルロースであるため，実際にイナワラ粉末のような前処理をしていない固体のセルロースも分解するか否かはこれでは判定できない．そこで，一般的にセルロース分解によく用いられる糸状菌Trichoderma viride由来の酵素を基準とし，固体セルロースの糖化においてイナゴの酵素がどの程度有用であるのかを検証した．

図2■イネ害虫腸内酵素のCMC糖化能

イナゴとショウリョウバッタは成虫由来，ニカメイチュウは幼虫由来の腸を，クエン酸緩衝液（pHは昆虫腸内pHに調整）中でホモジナイズし，遠心した上澄みを粗酵素液とした．酵素液の糖化活性は，昆虫1匹分の粗酵素液とCMC 50 mgを反応させたときの還元糖生成量を，ジニトロサリチル酸法（DNS法）にて測定し判定した．

イナゴ腸内酵素はイナワラ分解に特化している

次に，Trichoderma viride由来セルラーゼ（CELLULYSIN Cellulase, MilliporeSigma社製）とイナゴ腸内粗酵素について，CMCよりも糖化しにくい基質であるろ紙と前処理をしていないイナワラを基質として反応させたときの還元糖生成量を比べた．その結果，ろ紙を基質としたときは，セルラーゼ活性はほぼ同等だが（図3A図3■さまざまな基質に対するイナゴ腸内粗酵素の糖化能），イナワラを基質としたときはイナゴ腸内粗酵素の糖化率は，Trichoderma viride由来セルラーゼの約40倍と極めて高いことが明らかとなった（図3B図3■さまざまな基質に対するイナゴ腸内粗酵素の糖化能）．

図3■さまざまな基質に対するイナゴ腸内粗酵素の糖化能

A, B: Trichoderma viride由来セルラーゼとイナゴ腸内粗酵素のろ紙（A）およびイナワラ（B）の糖化能の比較．C: イネ科植物のイナワラ，ソルガム，ケンタッキー芝とろ紙を基質とした場合のイナゴ腸内粗酵素の糖化能の比較．ろ紙はセルロース含有量98％の高品質コットンリターで，1.0×6.0 cm（約50 mg）成型物を基質とした．イナワラ（品種：長香穀），ソルガム，ケンタッキー芝は粉砕し5 mmの篩を通過させたものを10倍量の沸騰水中で5分間加熱後，ろ過して元々含まれていた還元糖を除去し，その残渣を乾燥して基質（50 mg）とした．イナワラのケイ素含有量はSiとして6.37％であった．Trichoderma viride 由来セルラーゼ（2U）はpH 4.0, 40°Cで，イナゴ腸粗酵素（1匹分）はpH 6.6, 50°Cで基質と1時間反応させ，生成した還元糖量をDNS法により測定した．

続いて，イネ科植物のイナワラ，ソルガム，ケンタッキー芝およびろ紙を基質とした場合のイナゴ腸内粗酵素の糖化能を比較検討した．イナワラ，ソルガム，ケンタッキー芝のいずれもろ紙（セルロース）と比べると高い糖化能を示したが，その中でもイナワラの糖化能が著しく高かった（図3C図3■さまざまな基質に対するイナゴ腸内粗酵素の糖化能）．このことから，イナゴ腸由来の酵素はイネ科植物，特にイナワラを特異的に糖化する酵素であることが明らかとなった．

以上のことから，イナゴの腸内粗酵素は，イナワラを基質としても糖化酵素活性が高い優れたイナワラ糖化酵素を含んでいることが示された．具体的には，イナワラに特化したセルラーゼをもつ，あるいはイナワラに含まれるヘミセルロースも分解したため還元糖生成量が高くなったなどが考えられる．

イナゴ腸内ではセルロース分解とともにヘミセルロースの分解も行っている

イナゴの腸内粗酵素を精製し，イナワラ分解活性の高い画分に含まれる酵素を探索するため，イナゴの腸内粗酵素液を硫安塩析およびゲルろ過クロマトグラフィーにて分画し，イナワラ糖化能の活性が最も活性の高かった画分に含まれるタンパク質の同定をLC-MS/MSにて行った．その結果，この画分に含まれるセルロース分解関連酵素としてエンド-β-グルカナーゼ（EC 3.2.1.4）とβ-グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21），そしてへミセルラーゼとしてβ-ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.23）が検出された．

このことから，イナゴ腸内ではイナワラにエンド-β-グルカナーゼが作用することで，セルロースが分解されてセロビオースおよびセロオリゴ糖が生成し，生成したセロビオースおよびセロオリゴ糖にβ-グルコシダーゼが作用することでグルコースを生成していると考えられる．一方で，イナゴ腸内粗酵素液からは，非結晶性セルロースにはほとんど作用しないセルラーゼであるエキソセロビオヒドロラーゼは検出されなかった．イナワラは結晶セルロースを多く含有していることから，この酵素がイナワラを常食とするイナゴ腸内から検出されなかったことは矛盾しないと考える．また，イナワラにはセルロースと同程度のヘミセルロースが含まれていることから，イナゴの腸内酵素が示す高いイナワラ糖化活性は，セルラーゼ以外にヘミセルラーゼが存在することでセルロースの分解とともにヘミセルロースも分解されている可能性が考えられた．

イナゴ腸内に共生する細菌がイナワラのヘミセルロースを分解している

イナゴ腸内粗酵素から検出されたβ-グルコシダーゼ（EC3.2.1.21）は細菌のPrevotella multisaccharivoraxが分泌するタンパク質でもあることから，イナゴ腸内では，イナワラの糖化にはイナゴ自身が分泌する酵素だけでなく，腸内に共生する微生物由来の酵素も糖化に関与している可能性が考えられた．そこで，イナゴ腸内に棲息する微生物について調べるために，イナゴの腸から抽出したDNAを基に16s-rDNAをPCRで増幅させ，PCR-DGGE法を行った．その結果，採取時期や場所，生育ステージの異なるイナゴでも共通するバンドが検出され，イナゴの腸内細菌叢はある程度の普遍性があることが示された．

次にイナワラ分解能を有するイナゴ腸内細菌を単離するため，イナワラのみを炭素源とした培地を用いて集積培養を行った（図4A図4■イナゴ腸内共生微生物のセルロースおよびヘミセルロースの糖化能）．イナワラ培地で培養を繰り返すことでイナワラを資化できる菌株が濃縮される．この培養により895株の菌株を単離し，タンパク質あたりのイナワラ糖化活性がTrichoderma viride由来のセルラーゼよりも活性の高い菌株を45株選抜した．続いて，この45株の細菌が分泌するタンパク質のセルラーゼ活性とキシラナーゼ活性を測定した．キシロースはイナワラに含まれる主要な糖である⁽⁸⁾8) E. Y. Vlasenko, H. Ding, J. M. Labavitch & S. P. Shoemaker: Bioresour. Technol., 59, 109 (1997).ため，ヘミセルロース活性を検定する糖として選んだ．基質をセルロースとしたときの選抜菌が分泌する酵素の糖化活性は，すべての菌においてTrichoderma viride由来のセルラーゼと比べると半分以下の活性であった（図4B図4■イナゴ腸内共生微生物のセルロースおよびヘミセルロースの糖化能）．しかし，キシランを基質としたときの糖化活性は，Thermomyces lanuginosus由来キシラナーゼとほぼ同等の活性を示したものが10株存在した（図4C図4■イナゴ腸内共生微生物のセルロースおよびヘミセルロースの糖化能）．

図4■イナゴ腸内共生微生物のセルロースおよびヘミセルロースの糖化能

A: イナワラのみを炭素源とした培地を用いた集積培養．この培養により，イナワラを資化（糖化）できる菌株を濃縮し，895株のイナゴ腸内細菌を単離した．B，C: 集積培養により単離した菌株から，さらにイナワラ糖化能が高い45菌株を選抜した．5日間微栄養培地にて培養した45菌株の菌液3 mlに基質を加え，28℃で5日間振盪培養し，上澄みを回収し，菌液中のタンパク質量あたりの還元糖量を測定・算出した．横軸は菌株（番号は省略）．基質はセルロース粉末およびオートムギ由来キシランを50 mg使用した．左端のカラム（Web版では赤で示した）は，Trichoderma viride由来セルラーゼ（2U）およびThermomyces lanuginosus由来キシラナーゼ （2U）が生成した還元糖量を示す．また，図C中の白抜きのカラム（Web版では黄）はT. lanuginosus由来キシラナーゼとほぼ同等の活性を示した株を示す．菌液中のタンパク質量はBCA protein kit（Thermo製）にて測定した．D: イナゴ腸内での糖化のモデル図．イナゴ自身がセルラーゼを，イナゴの腸内細菌がヘミセルラーゼを分泌し，この両酵素の混合系でイナワラを効率よく糖化すると考えられる．

このキシラナーゼ活性の高かった菌株について，16s-rDNA塩基配列によって同定した結果，Bacillus属，Stenotrophomonas属，Enterobacter属，Microbacterium属と相同性が高いことがわかり，これらがイナゴの腸内で大きな役割をもっていることが示唆された．さらに，これら菌株が最もよくイナワラを糖化したときの培養液に含まれる分泌酵素について，LC-MS/MSにて解析をしたところ，ヘミセルラーゼであるβ-ガラクトシダーゼやβ-1,4-キシラナーゼなどが確認された．このことから，イナゴ自身がセルラーゼを，イナゴの腸内細菌がヘミセルラーゼを分泌し，この両酵素の混合系でイナワラを効率よく糖化するという役割分担があることが強く示唆された（図4D図4■イナゴ腸内共生微生物のセルロースおよびヘミセルロースの糖化能）．

おわりに～イナゴ腸内ではイナゴ由来の酵素と腸内共生細菌由来の酵素が協調してイナワラを糖化している～

本稿では，イネを用いたファイトレメディエーション後の有害物質含有収穫物，つまりイナワラを糖化し，最終的にエネルギー源として転換・利用することを考え，前処理なしでイナワラを糖化する方法として，イネを常食とするイナゴの腸内酵素に着目してその有効性を検討してきた．その結果，イナゴの腸内にイナワラを高効率に糖化することのできるセルラーゼとヘミセルラーゼが混在していることを発見した．また，イナワラの糖化においては，昆虫（イナゴ）–微生物（イナゴ腸内細菌）間の生物共生系における役割分担があることなど，興味深い事象を知ることができた．

現在，酵素の大量製法として，効率よく基質を糖化する酵素をコードしている遺伝子をイナゴから解読し，それを大腸菌で発現させるなどの方法を検討している．これらの酵素を利用することにより，バイオエタノールの原料としてファイトレメディエーション後の植物が容易に活用できるようになれば，農用地の浄化が普及し安全な食料生産に寄与できるとともに，バイオエタノールの普及が進み，再生可能な資源で地域資源を活用した安心で安全なエネルギー生産技術の実現につながると期待している．