シアノバクテリアの概日時計

地球の自転周期に同調した約24時間周期の概日時計は，多くの地表生物に内在し，生体の恒常性維持や時間依存的な細胞活動にも広く関係している⁽⁹⁾9) C. S. Pittendrigh: Annu. Rev. Physiol., 55, 16 (1993).．概日時計は遺伝子と蛋白質の複雑な相互作用によって成り立っており，担い手となる分子や作動メカニズムは生物によって異なる．それにも関わらず，多くの概日時計には温度補償性と呼ばれる温度による影響を受けない性質や，光や温度など周辺環境に位相を合わせる同調性といった共通点が見受けられる．これら温度補償性と同調性についての分子レベルのメカニズムは不明な点が多い．身近でありながら未だ謎が深い概日時計であるが，光合成細菌であるシアノバクテリアがよく研究対象として選ばれる．シアノバクテリアの概日時計は3種類の蛋白質KaiA, KaiB, KaiCとATPによって成り立っている．研究が始まった当初，時計遺伝子kaiA, kaiB, kaiCの転写翻訳フィードバック調節によって約24時間周期（概日周期）を刻んでいると考えられていたが⁽¹⁰⁾10) M. Ishiura, S. Katsuna, S. Aoki, H. Iwasaki, C. R. Andersson, A. Tanabe, S. S. Golden, C. H. Johnson & T. Kondo: Science, 281, 1519 (1998).，KaiA, KaiB, KaiCおよびATPを試験管内で混合することで，KaiCのリン酸化レベルが約24時間周期で増減することが2005年に報告された⁽¹¹⁾11) M. Nakajima, K. Imai, H. Ito, T. Nishiwaki, Y. Murayama, H. Iwasaki, T. Oyama & T. Kondo: Science, 308, 414 (2005).．生体分子の複雑な相互作用の上に成り立つと考えられていた概日時計が，たった3種類の蛋白質とATPの相互作用のみで構築できたのは大変な驚きである．試験管内で概日時計が再構築できる例は，現在でもシアノバクテリアしか知られていない．そのため概日時計のモデルとして広く知られ，蛋白質科学的なアプローチを駆使した分子レベルでの研究が最も進んでいる．

ここで概日周期を示すKaiCリン酸化サイクルについて解説する．概日時計の中心となるのがKaiCであり，KaiAはKaiCの自己リン酸化を促進し，KaiBはKaiAの働きを阻害することで自己脱リン酸化を促進する（図1図1■KaiCリン酸化サイクルにおけるKaiA, KaiBの役割）．KaiCは似た構造を持つ2つのドメインからなり，N末端側をCIドメイン，C末端側をCIIドメインと呼ぶ．それぞれのドメインが相互作用により6量体を形成し，2つのドーナツが重なった構造となっている．両ドメインにはそれぞれATP加水分解活性（ATPase活性）が備わっており，加えてCIIドメインはキナーゼ活性を有する．CIIドメイン内でT432およびS431が順にリン酸化，脱リン酸化を繰り返すが，ドメイン間には互いにアロステリックな相互作用が働いていると考えられ，CIドメインのATPase活性がCIIドメインのATPase活性とキナーゼ活性に影響を与える．興味深いことに，ATPase活性の高さをアミノ酸変異によって変化させたKaiC変異体を用いた実験から，リン酸化サイクルの周期長とATPase活性の高さの間には負の相関関係が存在することが報告された⁽¹²⁾12) K. Terauchi, Y. Kitayama, T. Nishiwaki, K. Miwa, Y. Murayama, T. Oyama & T. Kondo: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 16377 (2007).．これを境に，温度やpHなどの物理化学的要因による概日周期やATPase活性への影響が研究されるようになった．しかし，静水圧を用いた研究例は2019年にわれわれが報告するまで存在しなかった．われわれは高圧下での概日周期やATPase活性を観測し，Kai蛋白質が時を刻む上で重要な構造の揺らぎを発見した⁽⁴⁾4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).．

図1■KaiCリン酸化サイクルにおけるKaiA, KaiBの役割

KaiAはKaiCの自己リン酸化を促進し，KaiBはKaiAの機能を阻害し間接的にKaiCの自己脱リン酸化を促進する．

圧力は概日時計を早める

圧力下での概日周期を観測するために，まずトリプトファン蛍光測定に着目した．トリプトファンは疎水性のインドール環を側鎖に持ち，蛋白質内部に折り畳まれていることが多いため，トリプトファン励起に伴う蛍光測定によって蛋白質の構造変化を追跡できる．KaiCはCIドメインに1つ，CIIドメインに2つのトリプトファンを含んでいることから，リン酸化サイクルに伴う3つの蛋白質の離合集散や構造変化を蛍光強度として観測することができる．蛍光分光装置に耐圧光学セル（（株）シン・コーポレーション）を組み合わせることで，高圧下での蛍光測定が可能である．現在，同様な高圧蛍光装置は世界で広く利用されている．この高圧蛍光装置を用いて，1気圧，200気圧，100気圧，1気圧と圧力を変えながら順に蛍光強度の経時的変化を測定したところ，それぞれの圧力で蛍光強度の振動が観測された．振動の周期長は，1気圧で22時間であったが，100気圧で17時間，200気圧で14時間まで短縮した（図2図2■蛍光強度の振動と周期長）．減圧後には，周期長は再び元に戻ったことから，加圧による周期長の変化は可逆的であることがわかった．

図2■蛍光強度の振動と周期長

KaCのリン酸化サイクルとともに振動するトリプトファン蛍光強度（30°C）の圧力依存性^（4）4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).．挿入図は，周期長の圧力依存性．「Kitahara et al. Sci. Rep. 9, 12395 (2019) 図1より改変．

次に，高圧下でのKaiCのリン酸化レベルの変化を調べた．KaiA, KaiB, KaiCとATPからなるサンプルをシリコンチューブに分注し，圧力と温度を制御できる耐圧容器（（株）シン・コーポレーション）の中でインキュベーションした．それらを2～3時間毎に採取し反応をクエンチさせた後，SDS-PAGEを行い，リン酸化KaiCと非リン酸化KaiCの割合を定量した（図3図3■KaiCリン酸化サイクルにおけるリン酸化KaiC比率の振動）．この結果，KaiCのリン酸化サイクルは1気圧で22時間，200気圧下で14時間となり，高圧蛍光測定から求めた周期長と一致した．

図3■KaiCリン酸化サイクルにおけるリン酸化KaiC比率の振動

1気圧（○）と200気圧（●）におけるリン酸化KaiC比率の時間変化^（4）4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).．Kitahara et al. Sci. Rep. 9, 12395 (2019) 図2より改変．

トリプトファン蛍光強度およびリン酸化KaiC割合の各実験からリン酸化サイクルの周期長は圧力依存的に短縮することがわかった．これまでの先行研究からpHなどの影響で周期長が変化することは知られていたが，野生型KaiCにおいてここまで大きな変化をもたらしたのは圧力が初である．加圧によってKai蛋白質にどのような変化があったのか，次の章で議論したい．

ATPase活性における遷移状態は体積収縮する

上述したとおり，KaiCのリン酸化サイクルの周期長とATPase活性の高さには負の相関関係がある⁽¹²⁾12) K. Terauchi, Y. Kitayama, T. Nishiwaki, K. Miwa, Y. Murayama, T. Oyama & T. Kondo: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 16377 (2007).．加圧によって周期長が短縮したことから，KaiCのATPase活性の圧力依存性を調べた．KaiCを高圧下でインキュベーションし，生成されたADPの濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて測定し，その経時変化からk_catを算出した．k_catは酵素反応速度を表す値であり，これを基準に酵素活性の高さを評価することができる．1気圧でのk_catは14±2（day⁻¹）であり，100気圧では18±4（day⁻¹），200気圧では22±3（day⁻¹）となった（表1表1■野生型と変異体KaiCのATPase活性^（4）4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).）．k_catの小ささに驚かれたことと思う．これは他のATPaseに比べ数桁小さな値となっている．実は，この極めて低い活性こそが，24時間という極めて長い周期を制御する秘訣と考えられる⁽¹³⁾13) J. Abe, T. B. Hiyama, A. Mukaiyama, S. Son, T. Mori, S. Saito, M. Osako, J. Wolanin, E. Yamashita, T. Kondo et al.: Science, 349, 312 (2015).．さて，ATPase活性は圧力依存的に上昇していることがわかる．200気圧で周期長は1.5倍短縮され，酵素活性も1.6倍上昇していることから，高圧下でも周期長とATPase活性の関係性が成り立つことがわかる．またKaiCのCIIドメインを排除した変異体（CI-ATPase），CIドメインの触媒残基を変異させATPase活性を潰したE77Q/E78Q変異体（CII-ATPase）を作製し，CIドメイン，CIIドメインそれぞれのATPase活性を測定した．常圧下において，ATPase活性はCIドメインの方がCIIドメインよりも5倍ほど大きく，CIドメインのATPaseが概日周期のペースメーカーだと考えられている．しかし面白いことに，加圧による活性上昇率はCIIドメインの方が格段に大きかった．200気圧においてCIドメインの活性上昇率は1.2倍であったのに対し，CIIドメインのそれは2倍にも及んだ．また活性上昇率の圧力依存性からそれぞれのATP加水分解反応の活性化体積を算出するとCIドメインは−18±2 mL/mol, CIIドメインは−100±30 mL/molとなり，遷移状態では，CIIドメインのほうがCIドメインに比べて約5倍大きく体積収縮していることがわかった．KaiCの結晶構造を見てみると，CIIドメインの触媒残基付近には大きな空洞（キャビティー）が存在していた（図4図4■KaiCのATP加水分解に伴う体積収縮）．CIIドメインがCIドメインに比べてより大きな体積収縮ができるのはキャビティーが要因だと言えるだろう．上述のようにATP加水分解活性は非常に小さな値である．秋山らのX線結晶構造解析から，活性部位においてATPと加水分解に関わる水分子の位置が離れていることがわかっている⁽¹³⁾13) J. Abe, T. B. Hiyama, A. Mukaiyama, S. Son, T. Mori, S. Saito, M. Osako, J. Wolanin, E. Yamashita, T. Kondo et al.: Science, 349, 312 (2015).．このような原子配置が，活性化エネルギーを高め反応速度を極めて遅くしていると考えられる．これらの結果から，「KaiCの体積収縮により，ATPや水分子，触媒残基がコンパクトに集まった遷移状態を形成した時に化学反応が生じる」という仮説に至った．

図4■KaiCのATP加水分解に伴う体積収縮

（A） KaiC・ATP複合体の立体構造（PDB ID:1U9I）．2つのサブユニットを示す．CIはCIドメイン，CIIはCIIドメインを示す．（B） KaiCの加水分解前と遷移状態における触媒残基，水，ATP，空洞などの変化の様子を示す模式図．Kitahara et al. Sci. Rep. 9, 12395 （2019）図4図4■KaiCのATP加水分解に伴う体積収縮より改変．

ここまで高圧下でのKaiCリン酸化サイクルおよびATPase活性測定の実験結果を示した．高圧下で周期長は短縮し，KaiCのATPase活性は上昇する．また，ATPを加水分解する時にはKaiCの体積収縮を伴うことが判明した．次に，周期長を変化させたKaiCの変異体を作製し，ATPase活性の圧力依存性を調べた．KaiC-F470YとKaiC-R393CはそれぞれCIIドメインにアミノ酸変異を施した短周期変異体で，周期長はそれぞれ17時間と15時間である．また1気圧におけるATPase活性は野生型よりも高い．しかし加圧による活性上昇率（200気圧／1気圧比）は1.1と1.2と野生型の1.6よりも顕著に小さかった（表1表1■野生型と変異体KaiCのATPase活性^（4）4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).）．これら短周期変異体については活性化体積の算出に至っていないが，活性上昇率からは，負の活性化体積は野生型のそれより小さな値と言える．遷移状態の構造は野生型と同じとすると，加水分解前の状態が既にコンパクトな状態であったと考えられる．このことは，1気圧におけるATPase活性が野生型より高いこととも一致する．溶液中の蛋白質構造は動的で，その体積も絶えず揺れ動いている．周期長の決定因子であるATPase活性は，まれに生じる大きな体積収縮によって制御されていたのである．圧力実験を通して，蛋白質が概日時計として機能する上で必要な「体積揺らぎ」を突き止めることができた．

CIドメインとCIIドメインの相互作用

KaiCのATPase活性はCIドメインとCIIドメインの活性の総和となる．常圧において，CIドメインとCIIドメインのk_catの合計と野生型KaiCのk_catはおおむね一致することがわかる（表1表1■野生型と変異体KaiCのATPase活性^（4）4) R. Kitahara, K. Oyama, T. Kawamura, K. Mitsuhashi, S. Kitazawa, K. Yasunaga, N. Sagara, M. Fujimoto & K. Terauchi: Sci. Rep., 9, 12395 (2019).）．しかし，高圧になるにつれ，その差は開いていく．高圧下ではCIドメイン，CIIドメインの合計よりも野生型KaiCのATPase活性の方が高くなる．この事実は，CIドメインとCIIドメイン間で何らかの相互作用が働いていることを示唆する．上述のようにATP加水分解反応に伴って2つのドメインは体積収縮する．体積変化は構造変化と密接に関わっており，近接するドメインの構造及び活性にも影響するはずである．実際にどのような構造変化が生じるのかはX線結晶構造解析や溶液NMR法など原子レベルの構造研究が必要となるが，CIドメインのATPase活性つまり体積揺らぎによりCIIドメインのATPase活性及びキナーゼ活性が促進されるのではないだろうか．

おわりに

シアノバクテリアのKaiCリン酸化サイクルの圧力効果について概説した．加圧によりKaiCのリン酸化サイクルの周期長が短くなること，KaiCのATP加水分解反応は体積収縮を伴うことを発見した．温度補償性とは対照的に，数百気圧という蛋白質の静的な立体構造に大きな影響を及ぼさない圧力でも，反応の活性化体積が大きければ，反応速度の変化を通じて生命現象に大きな変化を及ぼす．地球表層の1気圧環境で生息するシアノバクテリアにとっては，温度変化に比べ圧力変化への適応は不要なのかもしれない．哺乳類の概日時計についても周期長に強く影響を与える蛋白質が判明している．圧力を用いた研究は，蛋白質の体積揺らぎを明らかにすることから他の概日時計の研究にも有効な手法となる．圧力軸や体積揺らぎは，これからの概日時計研究の新機軸となるだろう．