植物由来乳酸菌の開発

分類学上の定義ではないが，生息場所により乳酸菌は大きく3つに分類される．乳を発酵する酪農乳酸菌（食肉を発酵する乳酸菌も含め動物性乳酸菌という場合もある），ヒトや家畜などの動物の腸内や糞便より検出される腸管系乳酸菌，それと植物質の発酵にかかわる植物由来乳酸菌である．米菓製造を生業とする当社は，1990年代に新規米菓製品の開発を期して，植物由来乳酸菌による米の加工技術の研究に取り組んでいた．特に米由来の乳酸菌は，必然的に米に対する発酵力に優れており，米菓原料となる米粉の物性を改変し，米菓の良好な膨化性や食感の改良に効果があることを見出した．当時，さまざまな植物性の発酵食品より乳酸菌が分離・同定された報告はあったが，摂取による健康機能についての報告はみられなかった．植物由来乳酸菌⁽¹⁾1) 岡田早苗：微生物，4, 55 (1988).は，植物に含まれる生育阻害物質，たとえばタンニン酸，アルカロイド類，イソチオシアネート類，植物由来の酵素類など，さらには植物ごとの固有の成分があるような過酷でかつ複雑な環境下でも生育できる．動物性乳酸菌が牛乳成分を含む単純な環境下で純粋培養されてきたエリート種であるとすれば，植物由来乳酸菌はどんな環境でも適応したくましく生き抜くことのできる野生種の感が強い．多様な生育環境からくるさまざまな生理機能をもった乳酸菌が期待できること，植物由来乳酸菌を表示した商品が販売されていないことおよび当社の企業イメージにマッチすることから，この未知なる植物由来乳酸菌の研究・開発に挑戦した．分離源として米および米加工品を用い，乳酸菌を約300株分離した後，乳酸菌実験マニュアルに従い同定を行った．安全性の観点からLactobacillus属のみを一次選抜し，食品発酵試験により80株を二次選抜した．さらに抗変異原性試験，人口消化液耐性試験により，玄米より分離したL. casei subsp. casei 327株（以後L. casei 327）を最良株として選抜した．

L. casei 327発酵乳および加熱殺菌体の整腸作用

まずはL. casei 327の発酵乳（生菌）の整腸作用を調べるために，健康成人27名（うち便秘傾向者14名）にL. casei 327の発酵乳（100 g）を2週間摂取してもらい，アンケート方式により排便回数および排便量を調査した⁽²⁾2) 瀬野公子，熊谷武久，渡辺紀之，岡田早苗：食科工，47, 555 (2000).．その結果，摂取前と比較して，L. casei 327摂取期間中の便秘傾向者の排便回数が有意に増加することが明らかになった．次にL. casei 327の腸内生存性を調べるために，毎日排便のある被験者7名にL. casei 327を用いた発酵乳（100 g）を1週間摂取してもらい，糞便中のLactobacillus数をLBS寒天培地を用いて測定した⁽³⁾3) T. Kumagai, K. Seno, H. Kawamura, T. Watanabe & S. Okada: Food Sci. Technol. Res., 10, 143 (2004).．摂取前は10⁵ cfu/gであったが，摂取することにより10⁷～10⁸ cfu/gになり有意な増加を示した．そのコロニーを同定し，L. casei 327と同じ性状がみられた．よってL. casei 327はヒト消化液に対する耐性を有し，腸内へ到達することが示唆された．しかし摂取中止後5日で発酵乳摂取前の値に戻り，長期の定着性はみられなかった．乳酸菌の整腸作用試験は発酵乳を用いるのが一般的であるが，一方，死菌体でも整腸作用を有するとの報告があった．これらのことから，L. casei 327の死菌においても，その効果が期待できる可能性が考えられた．そこでL. casei 327の生菌粉末と加熱殺菌粉末（図1図1■L. casei 327加熱殺菌体粉末の外観と電子顕微鏡観察像）を調製して，両者の整腸効果を前後比較試験により比較した．加熱殺菌粉末を摂取すると，摂取前と比べて排便回数および排便量が有意に増加し，それらの値は生菌体と同等であった．このことからL. casei 327には，生菌体としてだけでなく，加熱殺菌体としても，整腸作用があることがわかった．

図1■L. casei 327加熱殺菌体粉末の外観と電子顕微鏡観察像

L. casei 327加熱殺菌体の整腸効果について追加検証を行うため，1日50 mg（菌数として500億個）のL. casei 327加熱殺菌体を含む錠剤もしくはプラセボ錠剤を2週間摂取させるランダム化二重盲検プラセボ対照比較試験を行い，排便回数，排便日数，排便量を調べた⁽⁴⁾4) Y. Saito, T. Mihara, M. Oki & T. Kumagai: Biosci. Microbiota Food Health, 37, 59 (2018).．排便に関するアンケート結果を表1表1■L. casei 327加熱殺菌体の摂取による整腸効果に示す．実測値を比較すると，L. casei 327加熱殺菌体摂取により，排便回数，排便日数が有意に高い値を示した．また摂取前からの変化量では，排便回数，排便日数，排便量のすべての項目で，L. casei 327群の方が高い値を示した．これらの結果からL. casei 327加熱殺菌体には整腸作用があることが，ランダム化比較試験においても立証された（表1表1■L. casei 327加熱殺菌体の摂取による整腸効果）．

セロトニンを介した整腸メカニズム

乳酸菌生菌の整腸メカニズムには，発酵乳中，もしくは腸に到達した乳酸菌により生成される短鎖脂肪酸が関与すると考えられている．しかし，L. casei 327加熱殺菌体の場合には，生きた乳酸菌とは異なるメカニズムが想定された．そこで腸の蠕動運動を司るセロトニン（5-hydroxytryptamine; 5-HT）という物質に着目した．5-HTは抗うつ薬のターゲットとして有名だが，体内の90％以上が腸に存在しており，その多くが腸クロム親和性細胞（Enterochromaffin cells; EC細胞）と呼ばれる腸に存在する細胞で生産，貯蔵されることが知られている⁽⁵⁾5) F. De Ponti: Gut, 53, 1520 (2004).．EC細胞は，消化物の通過刺激や腸内細菌の放出する短鎖脂肪酸に反応し，5-HTを分泌することで腸管運動を促進する^{(6, 7)}6) S. Fukumoto, M. Tatewaki, T. Yamada, M. Fujimiya, C. Mantyh, M. Voss, S. Eubanks, M. Harris, T. N. Pappas & T. Takahashi: Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 284, R1269 (2003).7) D. J. Heredia, E. J. Dickson, P. O. Bayguinov, G. W. Hennig & T. K. Smith: Gastroenterology, 136, 1328 (2009).．分泌された5-HTはコリン作動性神経に存在する5-HT₄受容体に作用し，大腸の縦走筋収縮を誘導することが報告されている⁽⁸⁾8) N. H. Prins, L. M. A. Akkermans, R. A. Lefebvre & J. A. J. Schuurkes: Br. J. Pharmacol., 131, 927 (2000).．マウスを用いた検討の結果⁽⁹⁾9) T. Hara, T. Mihara, M. Ishibashi, T. Kumagai & T. Joh: J. Funct. Foods, 47, 585 (2018).，L. casei 327加熱殺菌体の2週間の投与により，大腸粘膜内の5-HT陽性細胞数と5-HT濃度の有意な増加が確認された．5-HT合成の律速酵素であるトリプトファン水酸化酵素の遺伝子発現も増加した．同試験では，ビーズ排出を指標とした大腸通過時間の短縮も確認されている．これらの結果からL. casei 327加熱殺菌体の整腸作用は大腸の5-HT合成促進とそれに続くぜん動運動の活性化によるものと考えられた．

L. casei 327加熱殺菌体の肌の保湿作用

「便秘になると肌が荒れる」と言われるように，腸と肌は密接にかかわっていると考えられており，食物繊維や乳酸菌の摂取が薦められてきた．大矢らは1995年の便秘と食物繊維の摂取状況や意識との関連性を調べた報告において，男性よりも女性の方が便秘による身体への影響に「にきびや肌荒れ」を挙げる割合が約2倍であったと報告しており⁽¹⁰⁾10) 大矢靖子，米田泰子：栄養学雑誌，53, 385 (1995).，特に女性の意識ではおなかの調子と肌に強い結びつきがあることがうかがえる．近年では，大腸に存在する腸内細菌叢に注目が集まり，腸内細菌が作り出すフェノール類が血中へ移行し角層細胞の小型化を誘発することや⁽¹¹⁾11) R. Izuka: Microb. Ecol. Health Dis., 21, 50 (2009).，ビフィズス菌を含む発酵乳の摂取によって血中のフェノール量が減少することが報告されており⁽¹²⁾12) M. Kano, N. Masuoka, C. Kaga, S. Sugimoto, R. Iizuka, K. Manabe, T. Sone, K. Oeda, C. Nonaka, K. Miyazaki et al.: Biosci. Microbiota Food Health, 32, 33 (2013).，便通による体外への不要物の排出機能が肌状態の改善に重要であると考えられている．またセロトニンを介して自律神経に作用することで保湿効果を示す乳酸菌も報告されている⁽¹³⁾13) Y. Hori, H. Kaneda, Y. Fujisaki, R. Fuyuki, Y. Nakakita, T. Shigyo & K. Nagai: J. Appl. Microbiol., 116, 1274 (2014).．

われわれは整腸作用をもつL. casei 327加熱殺菌体には肌状態を改善する効果があるのではないかと考え，2回のランダム化二重盲検プラセボ対照並行群間比較試験を行った．1回目は，18～30才の肌が乾燥気味の若年女性60名を2群に分け，一方の群（L. casei 327群）にはL. casei 327 100 mg（1,000億個）を含む粉末，もう一方の群（プラセボ群）にはプラセボ粉末を6週間摂取してもらい，頬の「肌から蒸散していく水分量（transepidermal water loss; TEWL）」を測定した⁽¹⁴⁾14) 熊谷武久，木津有美，内山公子，渡邊令子：薬理と治療，45, 1295 (2017).．その結果，L. casei 327群では，プラセボ摂取群よりも，TEWLが低い値を示し，水分蒸散を抑制する傾向がみられた．そこでTEWLについてL. casei 327群の平均値（8.07）で分け層別解析を行ったところ，TEWLが8.07より高い場合，L. casei 327では，プラセボ群と比べて，摂取4週目のTEWLが有意に低く，摂取6週目でも低い傾向を示した．

2回目は，20～64歳の肌が乾燥しやすい女性60名を2群に分け，一方の群（L. casei 327群）にはL. casei 327 100 mg（1,000億個）を含む錠剤，もう一方の群（プラセボ群）にはプラセボ錠剤を8週間摂取してもらい，頬と上腕部のTEWLを測定した⁽¹⁵⁾15) Y. Saito, T. Mihara, K. Maruyama, J. Saito, M. Ikeda, A. Tomonaga & T. Kumagai: Biosci. Microbiota Food Health, 36, 111 (2017).（図2図2■L. casei 327加熱殺菌体の摂取による肌から蒸散する水分量への効果）．その結果，L. casei 327群では，プラセボ摂取群よりも，上腕部のTEWL変化量が摂取4週目で有意に低く，摂取8週目でも低い傾向がみられた．頬では群間で有意な差はみられなかったが，これは化粧品やマスク試用有無によって個人のばらつきが大きかったためと考えられた．以上の2回の試験より，L. casei 327加熱殺菌体の摂取により肌の水分蒸散を抑える，すなわち保湿に役立つ機能があることが明らかになった．

図2■L. casei 327加熱殺菌体の摂取による肌から蒸散する水分量への効果

A: 経表皮水分蒸散量（TEWL）とは体内から角層を通じて出ていく水分の量のことで，肌のバリア機能の指標となる．B: Group A: L. casei 327群，Group P: プラセボ群．平均値±標準偏差（文献（15）15) Y. Saito, T. Mihara, K. Maruyama, J. Saito, M. Ikeda, A. Tomonaga & T. Kumagai: Biosci. Microbiota Food Health, 36, 111 (2017).より引用）．

おわりに

平成27年3月まで，栄養機能食品および特定保健用食品（トクホ）の保健機能食品以外の食品に機能性を表示することはできなかった．しかしながら，平成27年4月1日の食品表示法の改正に伴い，事業者の責任の下，安全性・有効性の根拠を示し，事前に消費者庁長官に届出することにより機能性を表示できる「機能性表示食品制度」が始まった．この制度により，パッケージにさまざまな健康強調表示（ヘルスクレーム）を表示した商品が店頭に広がり，消費者が自身の目的にあった食品を適切に選ぶことができるようになった．機能性表示食品制度による機能性関与成分の評価には，最終製品中の機能性関与成分の含有量を明らかにしておくことが求められる．通常，乳酸菌の生菌数の試験法についてはBCP加プレートカウント寒天培地を用いた培養法が公定法として定められるているが，加熱殺菌体は死菌であるため培養法による測定ができなかった．そこで，DNAに結合する蛍光色素4′-6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）を用いて蛍光染色し，蛍光顕微鏡下で菌数を測定する定量試験方法と，L. casei 327に特異的なプライマーを用いたPCR法による定性試験方法を確立した．現在，当社ではL. casei 327加熱殺菌体（製品名「植物性乳酸菌K-1」）を機能性表示対応の食品素材として販売しており，「肌のうるおいを保つ」3件，「お通じを改善する」1件の届出実績を有している（2020年5月現在）．また，当社では抗アレルギー効果⁽¹⁶⁾16) M. Moroi, S. Uchi, K. Nakamura, S. Sato, N. Shimizu, M. Fujii, T. Kumagai, M. Saito, K. Uchiyama, T. Watanabe et al.: J. Dermatol., 38, 131 (2011).や免疫賦活化効果⁽¹⁷⁾17) Y. Saito, M. Fujii, T. Watanabe, K. Maruyama, Y. Kowatari, H. Ogata & T. Kumagai: Biosci. Microbiota Food Health, 36, 55 (2017).をもつLactobacillus paracasei K71加熱殺菌体の販売も行っている．今後，L. casei 327加熱殺菌体の健康機能だけでなくL. paracasei K71加熱殺菌体の免疫調節作用のさらなる可能性を追求し，人々の日々の健康管理の一助となる商品の開発に挑戦していきたい．