メタン発酵におけるセルロース分解の促進

セルロースは植物体を構成する主要な成分であり，農業残渣や食品残渣に多く含まれている．メタン発酵環境では，セルロースはClostridium cluster IIIに属するセルロース分解菌によって，特異的にオリゴ糖や単糖に分解され，後のエネルギー代謝の基質となる⁽³⁾3) M. D. Collins, P. A. Lawson, A. Willems, J. J. Cordoba, J. Fernandz-Garayzabal, P. Garcia, J. Cai, H. Hippe & J. A. E. Farrow: Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 812 (1994).．一方で，水素資化性メタン菌が嫌気環境中の余剰還元力を消費することでギブスの自由エネルギーが正に傾き，中間代謝物である低級脂肪酸の酸化分解が進むことが報告されている⁽⁴⁾4) A. J. M. Stams: Antonie van Leeuwenhoek, 66, 271 (1994).．しかしながら，実際のメタン発酵環境において，セルロース分解菌と水素資化性メタン菌の共生的な生育（微生物間相互作用）が，セルロース分解に対してどのような影響があるのかは知られていなかった．そこで筆者らは，自らがメタン発酵槽から分離したセルロース分解菌：Clostridium clariflavum CL-1株と市販の水素資化性メタン菌：Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH株とをセルロースを基質として嫌気的に共培養し，10 g/Lのろ紙（type 5A: Advantec）を主な炭素源として含む培地を用い，単菌培養時との比較を行った⁽⁵⁾5) D. Sasaki, M. Morita, K. Sasaki, A. Watanabe & N. Ohmura: J. Biosci. Bioeng., 114, 435 (2012).．その結果，セルロース分解量は2.9倍，CL-1株の菌体量は2.7倍に上昇し，併せて培養液中の酢酸濃度が増加した．つまり，水素資化性メタン菌によって水素が除去されることにより，図2図2■共培養におけるセルロース分解経路の促進の黒矢印の代謝が促進され，ATP生成に伴う菌体増殖および共生的なセルロース分解が促進されたと考えられた⁽⁵⁾5) D. Sasaki, M. Morita, K. Sasaki, A. Watanabe & N. Ohmura: J. Biosci. Bioeng., 114, 435 (2012).．

図2■共培養におけるセルロース分解経路の促進

バイオ電気化学システムのセルロース分解への利用

電気化学的な装置を微生物の培養に適用した電気培養が，近年，報告されている⁽⁶⁾6) J. C. Thrash & J. D. Coates: Environ. Sci. Technol., 42, 3921 (2008).．基本的には電気化学システムは（電子を受け取る）アノード・（電子を供給する）カソードから成り，必要に応じてアノードとカソードをイオン選択性膜で仕切ることもある．従来は微生物に直接，電極から電子を授受することにより微生物内の酸化還元バランスを変化させて代謝を変化させることが行われてきた．この方式では電極表面に近接した微生物しか制御することができない．ここではバルク溶液中の酸化還元状態を電気化学的に調整することで，電極から離れた微生物をも制御することを目指した⁽⁷⁾7) K. Sasaki, D. Sasaki, K. Kamiya, S. Nakanishi, A. Kondo & S. Kato: Curr. Opin. Biotechnol., 50, 182 (2018).（図3図3■バイオ電気化学システムにより溶液中の酸化還元状態を調整して電極から離れた微生物を制御するコンセプト）．なお，もとのバルク溶液中の酸化還元電位は，おおよそ−0.4 V（銀／塩化銀電極に対して）であった．

図3■バイオ電気化学システムにより溶液中の酸化還元状態を調整して電極から離れた微生物を制御するコンセプト

電気化学システムでは，電極電圧を任意に制御できる．そこで，設定電圧が上記のセルロース共培養に与える影響について試験を行った．システムとしてはポテンシオスタットを使用した3電極方式を用い（図4図4■バイオ電気化学システムと通電培養時の微生物生育曲線），作用電極の電位を−0.8, −0.3，ないしは＋0.6 V（銀／塩化銀電極に対して）に設定した培養と通電していない培養との比較を，10 g/Lのろ紙（type 5A: Advantec）を主な炭素源として含む培地を用いて行った⁽⁸⁾8) D. Sasaki, M. Morita, K. Sasaki, A. Watanabe & N. Ohmura: Biosci. Biotechnol. Biochem., 77, 1096 (2013).．その結果，−0.8 Vに通電したときにΔH株とCL-1株が，それぞれ6.0と2.2倍，培養終了時の菌体量が上昇していた（図4図4■バイオ電気化学システムと通電培養時の微生物生育曲線）．それに合わせてセルロース分解量，メタンガス発生量の増加および培養液中の酢酸濃度の増加，エタノール濃度の減少が観察された．水素を利用するメタン菌の活性化は，電気学的なタンパク質分解環境でも報告されており⁽⁹⁾9) D. Sasaki, K. Sasaki, M. Morita, S. Hirano, N. Matsumoto & N. Ohmura: J. Biosci. Bioeng., 114, 59 (2012).，通電によるメタン菌の特異的な菌体増殖・メタン生成の活性化が明らかとなった⁽⁸⁾8) D. Sasaki, M. Morita, K. Sasaki, A. Watanabe & N. Ohmura: Biosci. Biotechnol. Biochem., 77, 1096 (2013).．その結果として，種々の加水分解を担う細菌との種間水素伝達の頻度が増加し，上流のセルロースやタンパク質の分解が促進されたと考えられた．

図4■バイオ電気化学システムと通電培養時の微生物生育曲線

電気化学的前処理により導電性微生物付着担体を充填した後段でのセルロース分解・メタン生成増

上述のように，メタン発酵槽内に微弱な電流を掛けることにより，セルロースからのメタン生成速度を増加させられる．嫌気処理を社会実装するためには発酵槽を大規模に運転することが望ましいが，バイオ電気化学システムをスケールアップするためには（安価な材料とはいえ）炭素電極の表面積を大きくしなければならない．そこで本研究では，前段のバイオ電気化学システムと，後段の導電性微生物付着担体（炭素繊維）を充填した固定床式高温メタン発酵槽とに分割した．前段のバイオ電気化学システムを小規模にするために短い滞留時間で運転して，後段の固定床式高温メタン発酵槽を大規模にするために比較的に長い滞留時間で運転した．前段のバイオ電気化学システムには3電極方式を使用して，水の電気分解による水素生成を防ぐために微弱な電流（2.7 µA/cm²-炭素電極）を掛けた．目的は後段の固定床式発酵槽でのメタン（CH₄）生成を促進することである．前段の初期pHを酸性6.1に調整してバイオガス生成を抑制して，後段の初期pHを中性7.5にしてバイオガス生成に最適化した．前段についてはバイオ電気化学システムの比較対照として，バイオ電気化学システムに繋がっていない開回路の発酵槽を運転した（図5図5■2段発酵：バイオ電気化学システム→固定床式発酵槽（BES→FFR），開回路でのバイオ電気化学システム→固定床式発酵槽（NBES→FFR）の比較により電気化学的前処理の効果を明確化）．嫌気性分解ではセルロースの分解が律速段階となるため，粉末セルロースを主要な炭素源として含む培地［20 g/Lセルロースパウダー（商品コード07748-75）製造元：ナカライテスク，他塩・ミネラル等を含む］を基質として使用した⁽¹⁰⁾10) K. Sasaki, D. Sasaki, Y. Tsuge, M. Morita & A. Kondo: Biotechnol. Biofuels, 14, 7 (2021).（なお，本研究ではバイオ電気化学システムとして作用極側と対極側が分かれているH型のリアクターを使用しているが，作用極側と対極側を一体にしても良い）．