中分子ペプチド医薬の開発

近年，創薬分野において「創薬モダリティ」あるいは単に「モダリティ」という言葉が汎用されている．ここで言うモダリティは，創薬技術や治療手段を幅広く指しており，低分子医薬，中分子医薬，高分子医薬，抗体医薬，核酸医薬，抗体薬物複合体，CAR-T細胞などが該当する．特に，中分子サイズの抗原結合分子（抗原結合中分子）は，高分子医薬同様の高い治療効果や副作用の軽減効果，および，低分子医薬同様の安価な化学合成法や高い組織浸透効率など，従来の医薬品の長所を併せ持つ理想的な中分子医薬になると期待されている（表1表1■分子サイズによる医薬品の分類と特徴，文献1, 2を基に作成）^{(1, 2)}1) D. R. Cary, M. Ohuchi, P. Reid & K. Masuya: J. Synth. Org. Chem. Jpn., 75, 1171 (2017).2) A. M. Cuesta, N. Sainz-Pastor, J. Bonet, B. Oliva & L. Alvarez-Vallina: Trends Biotechnol., 28, 355 (2010).．そのためデザイン技術の高度化が急速に進められているが，現在までのところ，認可されているほとんどの中分子医薬は，天然に存在する生理活性ペプチドの配列や構造に基づいて開発されたものである．例えば，インスリンはもともと生体内に存在する分子量約6 kDaのペプチドで，インスリン受容体に結合して血糖値を低下させる作用を持つ．そのため，インスリンは1型糖尿病患者（インスリンを産生できない）の治療薬として1923年から既に100年近く使用されている．また，異種生物由来の毒性ペプチドからも医薬が開発されている．2004年に認可された鎮痛剤ジコノチドは，海洋に生息するイモガイの一種から発見された神経毒に含まれるオメガコノトキシンから開発された．ジコノチドは分子量約3 kDaで，神経細胞に発現するN型カルシウムイオンチャネルに結合してシグナルを遮断し，強力な鎮痛効果を発揮する．

一方，次世代の中分子ペプチド創薬では，天然の生理活性ペプチドが見つかっていない疾患に対して薬効を持つことが求められている．つまり，抗原に結合して治療効果を発揮するペプチドを人工的に作り出すことが必要となっている．しかし，天然アミノ酸は20種類存在するため，仮に15アミノ酸長，分子量2 kDa程度の小さなペプチドであっても，その配列多様性は20の15乗種類（328京種類）となり，全てのペプチドを合成して評価することはほぼ不可能である．このような状況において，薬効を持つ抗原結合中分子ペプチドを効率よく創出するためのデザイン技術の研究が世界中で進められている．

ペプチドディスプレイによる標的結合中分子の探索

様々なアミノ酸配列を持ったペプチドで構成されるペプチドライブラリーの中から，標的結合中分子を取得するためによく利用されるのがペプチドディスプレイ法である^(3～8)3) M. Friedman, E. Nordberg, I. Hoiden-Guthenberg, H. Brismar, G. P. Adams, F. Y. Nilsson, J. Carlsson & S. Stahl: PEDS, 20, 189 (2007).4) J. Lofblom, F. Y. Frejd & S. Stahl: Curr. Opin. Biotechnol., 22, 843 (2011).5) V. Ramamurthy, S. R. Krystek Jr., A. Bush, A. Wei, S. L. Emanuel, R. D. Gupta, A. Janjua, L. Cheng, M. Murdock, B. Abramczyk et al.: Structure, 20, 259 (2012).6) K. Skrlec, B. Strukelj & A. Berlec: Trends Biotechnol., 33, 408 (2015).7) U. H. Weidle, J. Auer, U. Brinkmann, G. Georges & G. Tiefenthaler: Cancer Genomics Proteomics, 10, 155 (2013).8) C. Zahnd, E. Wyler, J. M. Schwenk, D. Steiner, M. C. Lawrence, N. M. McKern, F. Pecorari, C. W. Ward, T. O. Joos & A. Pluckthun: J. Mol. Biol., 369, 1015 (2007).（図1図1■ペプチドディスプレイシステムによる標的結合ペプチドスクリーニングの概略図）．これは，遺伝子組換えによってファージ，大腸菌，酵母，哺乳類細胞などの細胞表層に局在するタンパク質にペプチドを融合することで，ペプチドを細胞表層にディスプレイ（提示）する方法である．まず，骨格となる中分子サイズのペプチドや小型タンパク質の分子表面のアミノ酸残基をコードする遺伝子を混合塩基で改変し，全てのアミノ酸が出現する遺伝子ライブラリーを作製する．次に，宿主ファージや宿主細胞に1種類ずつ遺伝子を導入することで，それぞれの宿主が異なる中分子をディスプレイしたライブラリーを構築する．続いて，その中から結合力を指標とするスクリーニングにより，抗原結合中分子をディスプレイしたクローンを同定する．ディスプレイされている中分子のアミノ酸配列は，宿主が保持している遺伝子配列を解析することで同定できる．この場合，強い抗原結合力を有する分子が得られやすいという長所がある一方で，抗原分子のどの領域に結合するかを制御することが出来ないため，スクリーニングで得られた抗原結合中分子の中から実際に薬効を示すものをさらに探索する必要がある．また，ペプチドディスプレイ技術は宿主の形質転換効率がボトルネックとなり，一度に評価できるクローン数に制限がある．この点を改良するために，現在はペプチドと遺伝子を直接連結させたcDNAディスプレイやmRNAディスプレイなども開発されているが，それでも評価できるのは最大1000兆種類程度であり，一度にランダム配列化して評価できるのは最大10アミノ酸程度となっている．

図1■ペプチドディスプレイシステムによる標的結合ペプチドスクリーニングの概略図

パラトープ模倣中分子ペプチドの創出

一般的に，抗体分子表面で抗原と結合する領域はパラトープ，抗原分子表面で抗体と結合する領域はエピトープと呼ばれ，各々の抗体と抗原の結合は，それぞれ異なるパラトープとエピトープの組み合わせを有している（図2図2■抗体と抗原の結合）．また，特定の抗体が結合する抗原内のエピトープを指す場合，抗体エピトープとも呼ばれる．ほとんどの抗体において，パラトープは相補性決定領域（Complementarity determining region, CDR）と呼ばれるループ構造で構成されている．CDRループのアミノ酸配列は抗体ごとに異なり，それぞれの抗体は異なるパラトープを形成するため，それぞれの抗原に特異的に結合することが可能になる．CDRループのアミノ酸配列を移植することでパラトープをコピーするCDR-grafting技術はこの原理に基づいており，マウスなどの異種由来抗体をヒト化して免疫原性を低下させるために一般的に使用され，初期の抗体医薬の多くはCDR-graftingにより創出されたものであった．この技術を応用し，CDRループのアミノ酸配列を利用して，抗原結合中分子を開発する研究も検討されている．しかしいくつかの成功例が報告されているものの⁽⁹⁾9) B. W. Park, H. T. Zhang, C. Wu, A. Berezov, X. Zhang, R. Dua, Q. Wang, G. Kao, D. M. O’Rourke, M. I. Greene et al.: Nat. Biotechnol., 18, 194 (2000).，多くの場合ではCDR由来ペプチドは抗原に結合せず，医薬や診断薬として認可されている例はない．

図2■抗体と抗原の結合

抗体分子表面で抗原と結合する領域はパラトープ，抗原分子表面で抗体と結合する領域はエピトープと呼ばれる．また，特定の抗体が結合する抗原内のエピトープを指す場合，抗体エピトープとも呼ばれる．

CDRループを元に抗体代替中分子を創出する際に注意が必要なのが，CDRループと同じアミノ酸配列を合成するだけではパラトープとして機能せず，その構造や構造安定性も重要なファクターであるという点である．近年，これらのパラメーターを分子モデリングと構造計算により最適化し，in silicoで抗原結合中分子をデザインする技術が多数報告されている．ワシントン大学のDavid Baker教授の研究グループを中心に開発が進められている分子モデリングソフトウェアRosetta⁽¹⁰⁾10) R. Das & D. Baker: Annu. Rev. Biochem., 77, 363 (2008).は，最も有望なデザインツールの1つである．インフルエンザウイルスの感染を防ぐ効果のあるヘムアグルチニン結合抗体の代替ペプチドを開発した例では，まずRosettaを利用して抗体中のCDRループ構造を維持した環状ペプチドをモデリングし，続いて分子動力学（MD）シミュレーションにより構造安定性に基づいてスクリーニングすることで，26アミノ酸長の2種類のペプチドがデザインされた．これらのペプチドを合成して結合力を解析すると解離定数いずれも100 nM以下であり，強く抗原に結合することが示されている⁽¹¹⁾11) A. M. Sevy, I. M. Gilchuk, B. P. Brown, N. G. Bozhanova, R. Nargi, M. Jensen, J. Meiler & J. E. Crowe Jr.: Structure, 28, 1114 (2020).．

CDR-graftingによるパラトープ模倣中分子ペプチドの創出

筆者らの研究グループは，骨格中分子にCDRループを移植することにより，抗体代替中分子を創出するデザイン技術の開発を進めてきた．上述のように，パラトープとして抗原に結合するためには，CDRループの構造と構造安定性が重要である．そこで，抗体同様にループの構造を安定化できる骨格中分子を用意し，そこにCDRループを移植することで高い特異性と強い結合力を持った中分子が創出できるのではないかと仮説を立てた．このコンセプトに基づいて開発された中分子を，Fluctuation-regulated affinity protein（FLAP）と命名した（図3図3■抗原結合中分子FLAPのコンセプト）．

図3■抗原結合中分子FLAPのコンセプト

FLAPのデザインにおいて，最初の重要なポイントは骨格中分子の探索である．筆者らは既に，MDシミュレーションにより適切な骨格中分子を選択する方法を開発している⁽¹²⁾12) T. Kadonosono, W. Yimchuen, Y. Ota, K. See, T. Furuta, T. Shiozawa, M. Kitazawa, Y. Goto, A. Patil, T. Kuchimaru et al.: Sci. Rep., 10, 891 (2020).．医薬として利用できる理想的な骨格の条件として，化学合成が可能であること，免疫原性が低いことがあげられる．そこでまず，120アミノ酸長以下でジスルフィド結合が少なく，ヒト由来の分子を選択する．続いて，候補分子の構造をMDシミュレーションにより平衡化し，分子表面に露出しているループ領域を同定する．この中で，特に構造安定性が高いループ領域を選び，20種類のモデルヘキサペプチドに置換して再度構造を平衡化し，それぞれ置換したペプチドの構造安定性を計算する．その結果，20種類全てのペプチドの構造を安定化できる場合，これを骨格中分子として選択する．このような手順により，既にいくつかの有用な骨格中分子を同定し，乳がんマーカーとして有名なHER2を標的とした抗体医薬TrastuzumabおよびPertuzumabのCDR由来ペプチドを移植することで，HER2結合FLAPの創出に成功している^{(12, 13)}12) T. Kadonosono, W. Yimchuen, Y. Ota, K. See, T. Furuta, T. Shiozawa, M. Kitazawa, Y. Goto, A. Patil, T. Kuchimaru et al.: Sci. Rep., 10, 891 (2020).13) K. See, T. Kadonosono, Y. Ota, K. Miyamoto, W. Yimchuen & S. Kizaka-Kondoh: Biotechnol. J., 15(12), 2000078 (2020).．

このように，分子モデリングやMDシミュレーションを活用することで，抗原結合中分子ペプチドのデザインは可能になりつつある．一方で，これらのデザイン方法は，元になる抗体医薬のアミノ酸配列や構造情報が必要であるという制限も残っている．しかし，AlphaFold2⁽¹⁴⁾14) J. Jumper, R. Evans, A. Pritzel, T. Green, M. Figurnov, O. Ronneberger, K. Tunyasuvunakool, R. Bates, A. Zidek, A. Potapenko et al.: Nature, 596, 583 (2021).のように高精度な構造予測ツールの開発が進んでいることもあり，今後はアミノ酸配列情報だけあれば，抗体構造予測，抗原との結合構造予測，中分子候補のモデリング，MDシミュレーションの組み合わせにより全てin silicoでデザインできるようになるかもしれない．

抗体エピトープ模倣中分子ペプチドの創出

少し話は変わるが，筆者らのこれまでの研究も含めて抗体代替中分子の開発においては，パラトープを模倣する中分子のデザイン技術が検討されてきた．一方で，パラトープとは全く異なるアミノ酸配列を持ちながら抗体と同じエピトープに結合できる中分子ペプチド，つまり，抗体エピトープを模倣した中分子ペプチドを創出することが可能になれば，アミノ酸情報や構造情報を使用しなくても元の抗体医薬と同じ薬効を持った代替分子が取得できると考えられる．しかし，これまで抗体エピトープを指標とするペプチドスクリーニング法は存在していなかった．

最近筆者らは，哺乳類細胞ディスプレイを利用した新たなペプチドスクリーニングシステムMonoclonal Antibody-guided Peptide Identification and Engineering（MAGPIE）の開発に成功した⁽¹⁵⁾15) K. See, T. Kadonosono, K. Miyamoto, T. Tsubaki, Y. Ota, M. Katsumi, S. Ryo, K. Aida, M. Minegishi, T. Isozaki et al.: Sci. Rep., 11, 22098 (2021).（図4図4■MAGPIEシステムによる抗体エピトープ模倣ペプチドスクリーニングの概略図）．MAGPIEシステムでは，抗原と候補ペプチドを1つの細胞膜上にディスプレイして反応させる．ここに蛍光標識した抗体（ガイド抗体，gAb）を加えることで，抗原上の抗体エピトープに抗体が結合可能かを判定する．ガイド抗体と同じ抗体エピトープを持つペプチドがディスプレイされている場合，抗体エピトープが隠されてしまうためガイド抗体は結合できない．一方，抗体エピトープとは異なる抗原内の領域に結合するペプチドや，そもそも抗原に結合しないペプチドがディスプレイされている場合は，ガイド抗体は抗体エピトープに結合できる．この原理に基づき，ライブラリーペプチドをコードする遺伝子を抗原発現細胞に導入してディスプレイし，ガイド抗体が結合しない細胞群をセルソーターで回収して遺伝子配列を解析することで，抗体エピトープ模倣中分子ペプチドを一括で同定できる．そこで，抗原をT細胞活性化マーカーCD25，ガイド抗体をCD25結合抗体医薬Daclizumabとして実証実験を行ったところ，ガイド抗体が結合しない細胞群において，Daclizumab代替中分子ペプチド配列が選択的に濃縮された．また，実際に化学合成して結合力を測定すると，解離定数30 nM程度の高性能な代替中分子ペプチドであることが示された．つまり，MAGPIEシステムを利用することで，抗体エピトープを指標としたスクリーニングが可能になることが明らかになった．MAGPIEシステムはガイド抗体のアミノ酸配列や構造情報を必要としないため，①構造が明らかにされていない抗体医薬の代替中分子を創出できる，②従来法では設計できないアミノ酸配列を持った高機能な中分子を取得できる可能性がある，といった特徴を持つ．現在も本システムの高度化および汎用化を目標に研究を続けている．

図4■MAGPIEシステムによる抗体エピトープ模倣ペプチドスクリーニングの概略図

中分子ペプチド医薬の特性

最後に，抗体と抗体代替中分子ペプチドを医薬として利用する際のモダリティレベルでの特徴の違いを紹介する．抗体医薬には様々な作用機序があることが知られている．一般的なのは，①抗原に結合した際に生体内の免疫システムと連携して抗原発現細胞に細胞死を誘導する活性であり，抗体依存性細胞傷害（ADCC），補体依存性細胞傷害（CDC），抗体依存性細胞貪食（ADCP）などがある．他には，②シグナル伝達に関わるリガンドあるいは受容体に結合してシグナルを遮断する活性，③受容体に結合して拮抗作用（アンタゴニスト）あるいは作動作用（アゴニスト）を引き起こす活性もある．中分子ペプチド医薬は免疫システムとの相互作用部位を持たないため，代替できるのは②および③の活性になる．そのため①の活性を持つ抗体医薬の代替中分子ペプチド医薬を開発するためには工夫が必要である．

また，中分子ペプチドと抗体が大きく異なる点として体内動態がある．抗体医薬は血中で非常に安定であり，半減期は2～4週間と言われている．一方，中分子ペプチドは分子量が小さいために速やかに腎排泄され，血中半減期は数時間である．そのため，抗体医薬と同様に静脈投与で同じ効果を求める場合には，患部へのデリバリー技術や徐放技術の利用が必要になる．しかし低分子医薬のように経口投与が実現された場合，体外排泄が速いという特徴を活かし，抗体医薬よりもさらに副作用が軽減された医薬になるのではないかと期待している．

今後の展望

計算科学的手法の発展により，結合力や特異性という点では抗体医薬を代替する抗原結合中分子ペプチドのデザインは可能になりつつある．しかし，これらを実際に医薬として開発するためには，作用機序や体内動態を始め，薬効，溶解性，免疫原性，など考慮すべき点が数多く存在している．このような複数の要素を同時に最適化するためには，機械学習の利用が適しているかもしれない．既に，抗体の結合力や溶解性を機械学習で改善するという報告は増えてきており⁽¹⁶⁾16) D. M. Mason, S. Friedensohn, C. R. Weber, C. Jordi, B. Wagner, S. M. Meng, R. A. Ehling, L. Bonati, J. Dahinden, P. Gainza et al.: Nat. Biomed. Eng., 5, 600 (2021).，中分子ペプチドへも適用できると思われる．引き続き，抗原結合中分子ペプチドのデザイン研究を進め，臨床応用へと展開したい．