多能性を持たない「逸脱細胞」

ヒトiPS細胞やヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）は，小さな玉石のような形状をしており，強い細胞間接着によりコンパクトなコロニーを形成する．ヒトiPS細胞やヒトES細胞を培養していると，しばしばコロニーの周辺や中心に，大きく扁平な細胞が出現する（図1図1■iPS細胞の培養中に生じた逸脱細胞）．このような細胞は「未分化状態から逸脱した細胞」という意味から「逸脱細胞」と呼ばれる^{(1, 2)}1) M. H. Kim, E. Masuda & M. Kino-oka: Biotechnol. Bioeng., 111, 1128 (2014). doi: 10.1002/bit.25188.2) M. H. Kim, Y. Sugawara, Y. Fujinaga & M. Kino-Oka: Sci. Rep., 7, 93 (2017). doi: 10.1038/s41598-017-00083-1.．逸脱細胞では多能性マーカー（例: Oct3/4, rBC2LCN, SSEA-3/4）の発現が失われ，ステージ特異的胚性抗原1（SSEA-1）が陽性になることが古くから知られている⁽³⁾3) J. A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, M. A. Waknitz, J. J. Swiergiel, V. S. Marshall & J. M. Jones: Science, 282, 1145 (1998). doi: 10.1126/science.282.5391.1145.．ヒトiPS細胞やヒトES細胞の一般的な品質評価法の一つとして，フローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの発現解析がある．SSEA-1は未分化マーカー遺伝子であるOCT3/4の発現低下に伴い発現増加することから，ヒトiPS細胞やヒトES細胞の未分化性と負の相関を示すマーカーとして以前から使用されている．ヨーロッパの細胞バンクEuropean Bank for induced Pluripotent Stem Cells（EBiSC）の基準では，SSEA-1陽性細胞の割合が10％以下であることがヒトiPS細胞やヒトES細胞の品質基準とされている⁽⁴⁾4) O. O’Shea, R. Steeg, C. Chapman, P. Mackintosh & G. N. Stacey: Stem Cell Res. (Amst.), 45, 101773 (2020). doi: 10.1016/j.scr.2020.101773.．しかし現在のフローサイトメトリーによる細胞表面マーカー解析は破壊的試験法であり，接着培養している細胞を剥離して解析する必要がある．そのため治療用細胞の製造に用いるヒトiPS細胞やヒトES細胞の一部を品質試験のために消費してしまう．そこで筆者らはSSEA-1陽性の逸脱細胞を，培養上清を用いて非破壊的に検査する技術の開発を試みた．

図1■iPS細胞の培養中に生じた逸脱細胞

iPS細胞の位相差顕微鏡画像．iPS細胞コロニーの周辺に細胞の形態が変化した逸脱細胞（黄色矢印）が生じている．

逸脱細胞の分泌タンパク質の同定

SSEA-1はルイスX（Galβ1-4（Fucβ1-3）GlcNAc）と呼ばれる糖鎖抗原であり，マウスでは多能性マーカーとして用いられているが，ヒトではiPS細胞やES細胞には発現せず，未分化性から逸脱した細胞に発現することが以前から知られていた．そこで逸脱細胞から培養上清中に分泌されるSSEA-1陽性糖タンパク質を同定し，それを測定する技術を開発すれば，培養上清を用いて逸脱細胞を非破壊的に検出できるのではないかと考えた．そこでまず逸脱細胞を人工的に作製する技術を構築した．iPS細胞を，熱不活性化サプリメント含有培養液を用いて，低密度に培養皿に播種して培養した．数日間の培養で，iPS細胞コロニーの周辺部の細胞間接着がゆるくなり，個々の細胞間の間隙が大きくなった．細胞密度が80％に達したとき，細胞を未分化細胞除去剤（rBC2LCN-PE38）で処理して，残存するiPS細胞を除去した^{(5, 6)}5) H. Tateno, Y. Onuma, Y. Ito, F. Minoshima, S. Saito, M. Shimizu, Y. Aiki, M. Asashima & J. Hirabayashi: Stem Cell Reports, 4, 811 (2015). doi: 10.1016/j.stemcr.2015.02.016.6) H. Tateno & S. Saito: Molecules, 22, 1151 (2017). doi: 10.3390/molecules22071151.．すると，大きく扁平化した細胞集団のみが濃縮された．予想された通り，扁平化した細胞は，初期分化マーカー（SSEA-1）で染色されたが，多能性マーカー（Oct3/4, Nanog, SSEA-4, rBC2LCN）では染色されなかった．

次に，逸脱細胞から培養上清中に分泌されるSSEA-1陽性糖タンパク質の探索を行った．iPS細胞と逸脱細胞，それぞれの細胞培養上清に含まれる糖タンパク質をO型糖鎖認識レクチンAgaricus bisporus lectin（ABA）で濃縮し，SSEA-1抗体でブロッティングを行った．その結果，逸脱細胞では＞250 kDaのタンパク質に強い反応性が検出された．そこで，このタンパク質をLC-MS/MSで解析したところ，フィブロネクチンであることがわかった．フィブロネクチン抗体で免疫沈降し，SSEA-1抗体およびフィブロネクチン抗体でウエスタンブロットした．その結果，逸脱細胞ではいずれの抗体でブロットした場合においても反応性が確認されたものの，iPS細胞では検出されなかった．そのためフィブロネクチンはSSEA-1のキャリアタンパク質であり，逸脱細胞の培養上清に検出されるもののiPS細胞の培養上清では検出されないことがわかった．さらにフィブロネクチン抗体で蛍光染色したところ，フィブロネクチン抗体は逸脱細胞表面を網目状に染色した（図2図2■フィブロネクチン抗体による免疫染色）．一方，iPS細胞はフィブロネクチン抗体で全く染色されなかった．そのためフィブロネクチンはiPS細胞から逸脱する過程で発現誘導され，分泌される糖タンパク質であると考えられた．

図2■フィブロネクチン抗体による免疫染色

iPS細胞および逸脱細胞の蛍光免疫染色画像．フィブロネクチン（赤），核（青）を示している．

逸脱細胞の非破壊検出技術

次に逸脱細胞から培養上清中に分泌されたSSEA-1陽性フィブロネクチンを検出するために，フィブロネクチン抗体を捕捉プローブ，SSEA-1抗体を検出プローブとしてサンドイッチELISA（FN-SSEA-1テスト）を構築した．iPS細胞および逸脱細胞の培養上清を連続希釈して分析した結果，逸脱細胞はFN-SSEA-1テストにより濃度依存的に検出されたが（黒丸），iPS細胞では反応が見られなかった（白三角）（図3A図3■FN-SSEA-1テストによる逸脱細胞数の算出）．FN-SSEA-1テストは逸脱細胞に対して高感度かつ特異的であり，検出下限値（LLOD, Lower Limit of Detection）は100 cells/mLであった．最後に，開発したFN-SSEA-1テストがiPS細胞に混入した逸脱細胞の検出に使用できるかどうかを評価した．それぞれ25,000個，12,500個，6,250個，0個の異なる数の逸脱細胞を，iPS細胞の存在下（白色）または非存在下（灰色）で培養した．その結果，逸脱細胞は，iPS細胞の存在下または非存在下のいずれにおいても細胞数依存的なシグナルが検出された（図3B図3■FN-SSEA-1テストによる逸脱細胞数の算出）．FN-SSEA-1テストから算出された逸脱細胞の見かけの細胞数は，実際の細胞数と同程度であり，iPS細胞に混在する5.9％の逸脱細胞を検出できた．したがってFN-SSEA-1テストを用いると，少量の培養上清を用いて非破壊的にiPS細胞に混入した逸脱細胞を定量測定することができる．そのため本技術は再生医療に用いるiPS細胞の非破壊的な品質試験へ実用化が強く期待される．

図3■FN-SSEA-1テストによる逸脱細胞数の算出

（A）逸脱細胞（黒丸）およびiPS細胞（白三角）の培養上清を用いたFN-SSEA-1テストでの検量線．（B）逸脱細胞の単独培養（灰色）およびiPS細胞との共培養（白色）時の培養上清を用いた逸脱細胞数の算出．

IR700を用いた光免疫療法による逸脱細胞除去

次にiPS細胞に混在する逸脱細胞を除去する技術の開発を目指した．その標的として，iPS細胞には発現しないものの逸脱細胞に発現するフィブロネクチンを選択した．フィブロネクチンは細胞外マトリックスタンパク質であるため，フィブロネクチン抗体は細胞に結合後，細胞内に取り込まれず，細胞表面に留まると考えられた．そのため，細胞内で毒性を示す一般的な薬物は利用できない．そこで近年がんの光免疫療法として開発が進んでいるIR700光吸収体に着目した^(7～12)7) M. Mitsunaga, M. Ogawa, N. Kosaka, L. T. Rosenblum, P. L. Choyke & H. Kobayashi: Nat. Med., 17, 1685 (2011). doi: 10.1038/nm.2554.8) T. Ali, T. Nakajima, K. Sano, K. Sato, P. L. Choyke & H. Kobayashi: Contrast Media Mol. Imaging, 9, 276 (2014). doi: 10.1002/cmmi.1570.9) K. Sato, R. Watanabe, H. Hanaoka, T. Harada, T. Nakajima, I. Kim, C. H. Paik, P. L. Choyke & H. Kobayashi: Mol. Oncol., 8, 620 (2014). doi: 10.1016/j.molonc.2014.01.006.10) A. A. Maawy, Y. Hiroshima, Y. Zhang, R. Heim, L. Makings, M. Garcia-Guzman, G. A. Luiken, H. Kobayashi, R. M. Hoffman & M. Bouvet: PLoS One, 10, e0121989 (2015). doi: 10.1371/journal.pone.0121989.11) K. Shimoyama, S. Kagawa, M. Ishida, S. Watanabe, K. Noma, K. Takehara, H. Tazawa, Y. Hashimoto, S. Tanabe, J. Matsuoka et al.: Breast Cancer Res. Treat., 149, 597 (2015). doi: 10.1007/s10549-015-3265-y.12) K. Sato, K. Ando, S. Okuyama, S. Moriguchi, T. Ogura, S. Totoki, H. Hanaoka, T. Nagaya, R. Kokawa, H. Takakura et al.: ACS Cent. Sci., 4, 1559 (2018). doi: 10.1021/acscentsci.8b00565.．光免疫療法ではまず，細胞表面に発現している特定のタンパク質に対する抗体にIR700光吸収体を標識する．IR700標識抗体を目的の細胞に反応させ，近赤外線を照射すると，IR700光吸収体が化学変化を起こす．すると抗体の立体構造が変化し，細胞膜を物理的に損傷させることで，細胞のネクローシスを引き起こす．そこでIR700光吸収体をフィブロネクチン抗体に標識し，近赤外線を照射することで，逸脱細胞を選択的に殺傷できるのではないかと着想した．

逸脱細胞の除去効率の検証

まず近赤外線照射により活性化したIR700標識フィブロネクチン抗体の細胞死誘導能を検証した．IR700標識フィブロネクチン抗体を逸脱細胞に作用させた後に近赤外線を照射した逸脱細胞の生存率を，生細胞染色（カルセイン-AM，緑）および死細胞染色（エチジウムホモダイマー1，赤）で解析した．未処理では，大きく扁平な形態を持つ逸脱細胞が緑色に染色され，ほとんどの細胞が生存していた（図4A図4■IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線処理）．一方でIR700標識フィブロネクチン抗体を反応させて近赤外線照射処理をした場合には，逸脱細胞は収縮して丸くなり，一部は培養液中に浮遊した．細胞の核が染色されたことから，ほとんどの細胞が死滅した．一方，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理は，iPS細胞の生存に影響を与えず，コロニーの形態も維持されていた（図4B図4■IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線処理）．これらの結果から，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理は，iPS細胞の生存に影響を与えずに，逸脱細胞にのみ作用し，細胞死を誘導することがわかった．

図4■IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線処理

（A）処理による逸脱細胞の細胞死への影響の検証．（B）処理によるiPS細胞の細胞死への影響の検証．生細胞（緑）と死細胞（赤）を示す．

次に，逸脱細胞を除去させるためのIR700標識フィブロネクチン抗体の濃度と近赤外線の照射時間の最適化を行なった．IR700標識フィブロネクチン抗体の濃度を10 ng/mLとし，近赤外線を10分間照射すると，逸脱細胞は97％以上死滅した．次に，IR700標識フィブロネクチン抗体の濃度を10 ng/mLに固定し，近赤外線照射時間を1～10分間に変化させて逸脱細胞の生存率への影響を検討した．その結果，逸脱細胞の生存率は照射時間依存的に低下し，5分間の照射でほぼ全てが死滅した．これらの結果から，IR700標識フィブロネクチン抗体10 ng/mLおよび10分間の近赤外線照射処理により，9割以上の逸脱細胞を除去できることがわかった．

iPS細胞に混入した逸脱細胞の選択的除去

最後に，iPS細胞に混在する逸脱細胞を選択的に除去できるかどうかを解析した．iPS細胞と逸脱細胞を共培養し，カルセイン-AM（緑）で生細胞を，エチジウムホモダイマー1（赤）死細胞を染色し，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射を行い，蛍光顕微鏡で細胞生存を観察した（図5A図5■抗体および近⾚外線処理による逸脱細胞の選択的除去の評価）．その結果，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理後，大きく扁平化した形態を持つ逸脱した細胞は消失し，細胞間相互作用が強固な高密度iPS細胞コロニーのみが残存している様子が観察された．

図5■抗体および近⾚外線処理による逸脱細胞の選択的除去の評価

（A）逸脱細胞とiPS細胞の共培養時の処理による細胞死への影響の検証．生細胞（緑）と死細胞（赤）を⽰す．（B）フローサイトメトリーによる逸脱細胞除去の定量評価．左のピークがiPS細胞，右のピークが逸脱細胞を示す．

さらに逸脱細胞の除去効率を定量化するため，未染色のiPS細胞とCellTracker Green CMFDA（緑蛍光）で染色した逸脱細胞を共培養し，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理をした際の細胞の生存率を解析した（図5B図5■抗体および近⾚外線処理による逸脱細胞の選択的除去の評価）．照射後24時間培養したのちに細胞を採取し，フローサイトメトリーで解析を行なった．左のピークがiPS細胞，右のピークが逸脱細胞を示している．その結果，未処理の場合，逸脱細胞は細胞集団の約33.8％を占めた．一方でIR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理条件では，逸脱細胞の割合が約1.8％と著しく減少した．これらの結果は，iPS細胞と共培養した場合でも，IR700標識フィブロネクチン抗体および近赤外線照射処理により，逸脱細胞を選択的に除去できることがわかった．

おわりに

本稿ではiPS細胞を培養していると発生する逸脱細胞を，見分けて，除く技術について紹介した．iPS細胞ではSSEA-3（R-Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-R），SSEA-4（NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-R），Tra-1-60/81（Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc），Hタイプ1（Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc），Hタイプ3（Fucα1–2Galβ1–3GalNAc），などの未分化糖鎖マーカーが発現している．一方，逸脱細胞ではSSEA-1（Lewis X）陽性になることが，1970年代から胚性がん（EC）細胞や胚性幹（ES）細胞を用いた研究で明らかにされていた^{(3, 13, 14)}3) J. A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, M. A. Waknitz, J. J. Swiergiel, V. S. Marshall & J. M. Jones: Science, 282, 1145 (1998). doi: 10.1126/science.282.5391.1145.13) D. Solter & B. B. Knowles: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5565 (1978). doi: 10.1073/pnas.75.11.5565.14) G. Walter, A. Intek, A. M. Wobus & J. Schöneich: Cell Differ., 15, 147 (1984). doi: 10.1016/0045-6039(84)90067-8.．また大阪大学の紀ノ岡教授のグループにより逸脱細胞に関する先駆的な一連の研究が行われ，ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを用いた逸脱細胞除去技術や，逸脱現象についての分子機構について報告されている^{(1, 2)}1) M. H. Kim, E. Masuda & M. Kino-oka: Biotechnol. Bioeng., 111, 1128 (2014). doi: 10.1002/bit.25188.2) M. H. Kim, Y. Sugawara, Y. Fujinaga & M. Kino-Oka: Sci. Rep., 7, 93 (2017). doi: 10.1038/s41598-017-00083-1.．逸脱細胞は未分化状態から逸脱し，分化した細胞であると考えられるが，どのような分化状態なのか，発生段階なのか，均一か不均一化か，など未だ多くの疑問が残る．現在我々は逸脱細胞の正体を暴くことを目的として様々なオミクス解析を進めている．