1. ヨーグルトの定義

食品の国際規格（Codex規格）⁽¹⁾1) CODEX STANDARD FOR FERMENTED MILKS, CODEX STAN 243–2003.において，ヨーグルトとは「Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus（ブルガリア菌）とStreptococcus thermophilus（サーモフィラス菌）の共発酵品」と定義されている．ヨーグルト製造に使われる乳酸菌をヨーグルトスターター（種菌）と言うが，一般にこの2菌種を指す（図1図1■ヨーグルト発酵における乳酸菌の共生関係）．

図1■ヨーグルト発酵における乳酸菌の共生関係

さらにCodex規格ではブルガリア菌以外のLactobacillus属乳酸菌を用いた場合には，ヨーグルトではなく「カルチャー代替ヨーグルト（Alternate Culture Yoghurt）」と定義されている．

日本では牛乳や乳製品などについての成分規格や製造基準などを定める「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（通称：乳等省令）」⁽²⁾2) 乳及び乳製品の成分規格等に関する省令，昭和26年12月27日厚生省令第52号．において，ヨーグルトとカルチャー代替ヨーグルトの区別はなく，いずれも「発酵乳」として扱われている．

2. ヨーグルト発酵における乳酸菌の共生関係⁽³⁾

ヨーグルトとは，乳に乳酸菌を添加して発酵させた食品である．より具体的に表すと，乳中で乳酸菌が増殖する際，乳糖を分解して乳酸を産生（乳酸発酵）し，この乳酸によって乳たんぱく質が凝固したものと言える．

L. delbrueckii subsp. bulgaricus（ブルガリア菌）とS. thermophilus（サーモフィラス菌）はそれぞれ単菌でも発酵を進めることが出来るが，発酵終了までに長い時間（菌株によるが十数時間以上）を要する．一方，両菌種を一緒に植えると，お互いに生育に必要な栄養素を提供し合うことで両菌種の増殖性が向上し，単菌発酵時よりも短時間でヨーグルトの発酵が完了する．このような発酵促進作用はブルガリア菌とサーモフィラス菌の共生関係に起因し，ブルガリア菌からサーモフィラス菌に提供されるペプチドと，サーモフィラス菌からブルガリア菌に提供されるギ酸が，主要な共生因子であることが見いだされている（図1図1■ヨーグルト発酵における乳酸菌の共生関係）．このブルガリア菌とサーモフィラス菌の共生関係のおかげで，数時間という短時間でヨーグルトを作ることができるのである．

1. 発酵乳の起源⁽⁴⁾

人類が羊や牛といった動物を家畜化したのは，羊はイラクにおいて紀元前8800年，牛はアナトリア（黒海，エーゲ海，地中海に囲まれた半島）で紀元前7000年頃と考えられている．同時期のアナトリアの土器に乳脂肪由来成分が付着していたことから，このころから牛の家畜化と共に乳を採取していたと考えられている．

乳は常温で放置すると環境から混入した微生物の働きによって自然に発酵する．汚染菌の場合は腐敗するが，乳酸菌が混入した場合，数時間でヨーグルトのようになるため，この時期ヨーグルトの原型は自然発生的に誕生したのではないかと考えられている．

2. ヨーグルトの語源^{(4, 5)}

世界には様々な発酵乳が存在し，それぞれの国の名前で呼ばれている．現在，広く一般に使われているヨーグルトという言葉は，トルコ語起源説とバルカン半島東部に暮らしていた古代トラキア人が使っていたトラキア語起源説がある．前者はトルコ語でヨーグルトを表すYoğurt（ヨールト）に由来し，後者はトラキア語のyog（ヨぐ：硬い）とurt（ウルト：ミルク）の複合語であるとされ，トルコ起源説が有力と考えられている．

3. 世界の発酵乳^{(4, 6)}

世界中には400種類もの発酵乳が存在していると考えられているが，ここでは，筆者が論文調査によって，ヨーグルトスターターであるL. delbrueckii subsp. bulgaricus（ブルガリア菌）とS. thermophilus（サーモフィラス菌）の分離報告例を認めた発酵乳を紹介する．

4. 日本における発酵乳^{(4, 12)}

日本での乳利用は飛鳥時代に朝鮮半島からの渡来人が孝徳天皇（645～654年）に牛乳を献上したことに端を発し，牛乳を加工した「酪」, 「蘇」, 「醍醐」などの乳製品が作られるようになった．これら牛乳・乳製品は平安時代まで貴族中心に利用されてきたが，鎌倉時代に入って律令制度の崩壊とともに，乳文化は消滅した．

日本で再び乳製品が復活するのは1894年（明治27年）で，ある牛乳販売店が牛乳の販路拡大および余剰乳処理の手段として「凝乳」と称したヨーグルトを整腸剤という触れ込みで発売した．ちなみに，ヨーグルトという言葉が初めて使用されたのは大正時代と言われている．

その後，1919年にモンゴルの酸乳にヒントを得た「カルピス」が，1935年は「ヤクルト」が発売された．1950年（昭和25年），日本初の本格的なヨーグルト「明治ハネーヨーグルト」の工場生産が始まった．ハネーヨーグルトは甘味を加えて寒天で固めたハードヨーグルトと呼ばれるものであり，このヨーグルトの登場以降，ヨーグルトを半固形状にしてフルーツなどを加えたソフトヨーグルト（1969年），甘味がついていないプレーンヨーグルト（1971年），ヨーグルトを液状にしたドリンクヨーグルト（1977年），冷凍してアイス状にしたフローズンヨーグルト（1979年）と，様々なタイプのヨーグルトが作られ食卓に広がっていった．

1. 香気成分によるプロファイリング

生乳から高頻度で分離される菌種を中心にLactobacillus属，Lactococcus属，Leuconostoc属，Pediococcus属，Streptococcus属から成る18種143株について，発酵乳中の香気成分および有機酸を分析した．検出された香気成分44種，有機酸10種について主成分分析を行った結果，アルコールを産生する絶対ヘテロ乳酸発酵型の乳酸菌（以下，絶対ヘテロと略）とLactococcus属，その他菌種で大きく3つのクラスターに分かれた（図3（a）図3■香気成分の主成分得点散布図）．絶対ヘテロとLactococcus属の特徴が際立っていたため，それ以外の菌種についてはその特徴を読み取ることができなかった．そこでLactobacillus属11種98株を対象に主成分分析したところ，発酵型（絶対ホモ，通性ヘテロ，絶対ヘテロ）によって3つに大別された（図3（b）図3■香気成分の主成分得点散布図）．さらに，発酵型別に解析すると菌種別に分かれたことから，菌種別に特徴的な香気成分プロファイルの存在が示唆された（図3（c），（d），（e）図3■香気成分の主成分得点散布図）．

図3■香気成分の主成分得点散布図

（a）18種143株，（b）Lactobacillus属11種98株，（c）絶対ホモ3種50株，（d）通性ヘテロ5種31株，（e）絶対ホモ3種17株．

2. 水溶性成分によるプロファイリング

特徴的な香気プロファイルを示した6種47株の乳酸菌（L. delbrueckii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, S. thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris）に対象を限定し，香気成分分析および有機酸分析に加えてCE-TOFMS分析による水溶性成分分析を実施した．機器分析により有機酸8種，香気成分44種，水溶性成分234種（ペプチド不含）が検出された．6菌種の香気成分について主成分分析した結果，L. fermentum（絶対ヘテロ），Lactococcus属およびL. paracasei，その他菌種の3つに分かれ，前項の結果（図3（a）図3■香気成分の主成分得点散布図）と同様の結果が得られた（図4（a）図4■6種47株を対象とした（a）香気成分および（b）水溶性成分の主成分得点散布図）．水溶性成分について解析した結果，供試した6菌種のうち5菌種すべてが分かれ（図4（b）図4■6種47株を対象とした（a）香気成分および（b）水溶性成分の主成分得点散布図），水溶性成分の方が香気成分よりも菌種毎の特徴を明確に反映する結果となった．これは香気成分に比べ水溶性成分の成分数が多いことに起因する．以上の結果から，菌種毎に特徴的な水溶性成分プロファイルが存在することが示唆された．

図4■6種47株を対象とした（a）香気成分および（b）水溶性成分の主成分得点散布図

1. L. delbrueckiiの亜種とその同定方法について

現在，L. delbrueckiiには6つの亜種；L. delbrueckii susbp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis⁽²⁰⁾20) N. Weiss, U. Schillinger & O. Kandler: Syst. Appl. Microbiol., 4, 552 (1983).，L. delbrueckii subsp. indicus⁽¹⁰⁾10) F. Dellaglio, G. E. Felis, A. Castioni, S. Torriani & J. E. Germond: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 401 (2005).，L. delbrueckii subsp. sunkii⁽²¹⁾21) Y. Kudo, K. Oki & K. Watanabe: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 62, 2643 (2012).，L. delbrueckii subsp. jakobsenii⁽²²⁾22) D. B. Adimpong, D. S. Nielsen, K. I. Sorensen, F. K. Vogensen, H. Sawadogo-Lingani, P. M. Derkx & L. Jespersen: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 63, 3720 (2013).が報告されており，ヨーグルトスターターとして知られているブルガリア菌（L. delbrueckii subsp. bulgaricus）はL. delbrueckiiの6亜種のうちの1亜種である．

L. delbrueckiiの亜種は，7種のハウスキーピング遺伝子（fusA, gyrB, hsp60, ileS, pyrG, recA, recG）を対象としたMultilocus Sequence Analysisを用いて分類する方法（MLSA法）が2011年にTanigawaらによって報告されている⁽²³⁾23) K. Tanigawa & K. Watanabe: Microbiol, 157, 727 (2011).．この方法は，複数のハウスキーピング遺伝子を全て繋いだ連結配列をクラスター解析し，対象菌株がどのクラスターに含まれたかによって亜種を決めるものである．TanigawaらはMLSA法によってL. delbrueckiiが5つのクラスター（MLSAクラスターと呼称）に分かれ，うち4つのクラスターが当時報告されていた4つの亜種に相当することを示した（1：lactis, 2: delbrueckii, 3: none, 4: bulgaricus, 5: indicus）．クラスター3は2つのサブクラスター3a, 3bに分かれ，当時いずれも対応する亜種が存在しなかったが，翌年2012年にKudoら⁽²¹⁾21) Y. Kudo, K. Oki & K. Watanabe: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 62, 2643 (2012).によってクラスター3aを新亜種sunkiiとする論文が発表された．このときクラスター3bに分類された菌株はsunkiiに含められなかったことから，クラスター3bの菌株には亜種名がつかないままとなった（表2表2■L. delbrueckii亜種分類結果の比較，サブクラスター3bを本稿ではsunkii近縁種と呼称する）．さらに，2013年にAdimpongら⁽²²⁾22) D. B. Adimpong, D. S. Nielsen, K. I. Sorensen, F. K. Vogensen, H. Sawadogo-Lingani, P. M. Derkx & L. Jespersen: Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 63, 3720 (2013).がlactisクラスターであるクラスター1に属する1菌株を新亜種jakobseniiとする論文を発表したことにより，その後クラスター1に分類された菌株の亜種名をlactisあるいはjakobseniiいずれにも決定できなくなった．このようにL. delbrueckii亜種の分類には分類学上の課題が存在することから，我々は亜種名ではなくクラスター名を用いている．

また，筆者ら⁽²⁴⁾24) H. Tsuchihashi, A. Ichikawa, M. Takeda, A. Koizumi, C. Mizoguchi, T. Ishida & K. Kimura: J. Dairy Sci., 105, 2082 (2022).はMLSA法を用いて多数のL. delbrueckiiの亜種の同定を行う過程で，hsp60遺伝子のアレル型を分類すると4つのグループ（1～4）に分かれること，各グループがMLSAのクラスターすなわち各亜種に対応することを見出し，この方法がL. delbrueckii亜種の簡易分類法として実用に足ることを確認している（表2表2■L. delbrueckii亜種分類結果の比較）．なお，hsp60とは真核生物での名称であり，原核生物ではgroELと称するのが正しいが，本研究では参考論文の表記に倣い，hsp60と記載する．

2. 生乳由来L. delbrueckii 226株の亜種の分布⁽²⁴⁾

生乳由来L. delbrueckiiの亜種の分布を推定することを目的として，北海道産生乳由来226株についてhsp60遺伝子配列を解析した．その結果，226株のhsp60遺伝子は新規8種（No. 18以降）を含む14種（表2表2■L. delbrueckii亜種分類結果の比較，太字表記）のアレル型に分類された．これらアレル型の種類とそれぞれの検出数から，226株中のMLSAクラスターの分布を導き出すとクラスターI（lactisあるいはjakobsenii）が226株中199株と最も多く，88.1％占めていた．それ以外は，クラスターIII（sunkiiあるいはsunkii近縁種）が26株で全体の11.5％，推定indicusが1株検出され，クラスターII（delbrueckii）およびクラスターIV（bulgaricus）は検出されなかった（表2表2■L. delbrueckii亜種分類結果の比較）．14種類のアレル型のうち，No. 18（126株，55.8％）が最も多く，次いでNo. 4（50株，22.1％）が多いことが明らかになった（図5図5■生乳由来L. delbrueckii 226株のhsp60アレル型の分布）．

図5■生乳由来L. delbrueckii 226株のhsp60アレル型の分布

次に，代表的なhsp60アレル型を持つ26株を対象にMLSA法で亜種を同定したところ，簡易分類と同じMLSAクラスターに分類されることを確認した．さらに，これまでに報告のないサブクラスターI-B1が形成され（図6図6■北海道産生乳由来L. delbrueckii 26株のMLSA解析結果），このサブクラスターはhsp60アレル型No. 18, 26, 27を有する全ての株とNo. 4を有する一部の株（5株中3株，60％）で構成されていた．生乳由来L. delbrueckii 226株中のhsp60アレル型の分布から，サブクラスターI-B1に属する菌株（I-B1菌群）は7割近くを占めると推定され，生乳由来L. delbrueckiiの最優勢菌群である可能性が示唆された．

図6■北海道産生乳由来L. delbrueckii 26株のMLSA解析結果

前項の香気成分によるプロファイリング結果から，I-B1菌群はブルガリア菌（クラスターIV）と比べて，ヨーグルトの爽やかな香りと表現されるアセトアルデヒドの産生が少ないことが明らかになっている（図7図7■ブルガリア菌（IV）とI-B1菌群におけるアセトアルデヒド産生量の比較）．

図7■ブルガリア菌（IV）とI-B1菌群におけるアセトアルデヒド産生量の比較

3. 生乳由来S. thermophilusの解析

細胞壁結合型プロテアーゼをコードするprtS遺伝子を有するS. thermophilusは，自身でペプチドを獲得することで，単菌でも高い発酵性を示す株が存在することが古くから報告されている⁽²⁵⁾25) S. Shahbal, D. Hemme & M. Desmazeaud: Lait, 71, 351 (1991).．しかし，prtS遺伝子保有株（prtS+株）は少なく，2010年に発表された論文では，フランスINRAのコレクション135株のうち，prtS+株はわずか21株（15.6％）であったことが報告⁽²⁶⁾26) C. Delorme, C. Bartholini, A. Bolotine, S. D. Ehrlich & P. Renault: Appl. Environ. Microbiol., 76, 451 (2010).されており，実際当社でヨーグルト製造に利用しているS. thermophilusはすべてprtS遺伝子非保有株（prtS−株）であった．Yamamotoら⁽²⁷⁾27) E. Yamamoto, R. Watanabe, A. Koizumi, T. Ishida & K. Kimura: Biosci. Microbiota Food Health, 39, 169 (2020).は当社国産生乳由来S. thermophilus 172株について調べ，59株（34.3％）にprtS遺伝子が存在することを明らかにした．

4. 日本オリジナルのヨーグルトの開発

以上の検討から国産生乳由来乳酸菌（I-B1菌群およびprtS+株）は，ヨーグルトスターター（ブルガリア菌およびprtS−株）とは異なる性質を有していることが明らかになった．そこで我々は十勝産生乳由来L. delbrueckii 159株，S. thermophilus 65株からL. delbrueckii OLL204989（I-B1菌群）とS. thermophilus OLS4496（prtS+株）を選抜した．当社では，ヨーグルトスターターの組み合わせに名前を付けており，十勝産生乳から分離したこれら2株には「十勝ミルク乳酸菌TM96」と名付け（図8図8■十勝産生乳由来ヨーグルトスターター「十勝ミルク乳酸菌TM96」），これを用いて日本オリジナルのヨーグルト（国産生乳と国産生乳由来乳酸菌を使用した発酵乳，codex規格のカルチャー代替ヨーグルト）を開発し，2019年3月に上市した．TM96で作ったヨーグルトはブルガリア菌を使用していないため，codex規格のヨーグルトではなく，カルチャー代替ヨーグルトになる．

図8■十勝産生乳由来ヨーグルトスターター「十勝ミルク乳酸菌TM96」