ケーススタディー1．ニホンウナギ

ニホンウナギ（Anguilla japonica）は東アジアにおいて水産養殖において最も重要な種の1つであるが，その種苗は未だ天然シラスウナギ（体の透明なニホンウナギの稚魚）に依存している．しかしながら，近年，ニホンウナギの分布域全域でシラスウナギの来遊量がかつて無いほどに低水準となり，養殖用種苗確保が困難になりつつある．持続可能な漁獲や資源保護を行なう上で，ニホンウナギの正確な集団構造に関する情報は必須不可欠である．ニホンウナギは成熟が近づくと降海し，マリアナ諸島西方海域で産卵する⁽¹⁾1) K. Tsukamoto, S. Chow, T. Otake, H. Kurogi, N. Mochioka, M. J. Miller, J. Aoyama, S. Kimura, S. Watanabe, T. Yoshinaga et al.: Nat. Commun., 2, 179 (2011).．日本，台湾，中国，韓国，フィリピンなど，東アジアの亜熱帯から温帯にかけて広く分布するニホンウナギのすべてが狭い産卵海域に回帰することから，ニホンウナギ種全体で1つの大集団（遺伝的に均一な集団）を形成していると考えられていたが，2006年に台湾の研究グループがDNAマーカーを使って分布域の南北標本間に遺伝的な差異があることを示唆する発表を行った⁽²⁾2) M. C. Tseng, W. N. Tzeng & S. Lee: Mar. Ecol. Prog. Ser., 308, 221 (2006).．その後，台湾の別のグループと日本のグループがこれを否定する見解を発表したが^{(3, 4)}3) Y. S. Han, C. L. Hung, Y. F. Liao & W. N. Tzeng: Mar. Ecol. Prog. Ser., 401, 221 (2010).4) Y. Minegishi, C. V. Henkel, R. P. Dirks & G. E. E. J. M. van den Thillart: Mar. Biotechnol., 14, 583 (2012).，いずれも少数の遺伝子座に基づくもので，標本間で遺伝子頻度などに差異のない領域ばかりを偶然に調べた可能性が捨てきれなかった．

そこで，我々は国内外の河川，河口域および産卵海域から採集したニホンウナギについて，全ゲノムリシーケンスを実施し，3,000万以上というこれまでにない大規模なSNPマーカーを用いた集団構造解析を行った⁽⁵⁾5) Y. Igarashi, H. Zhang, E. Tan, M. Sekino, K. Yoshitake, S. Kinoshita, S. Mitsuyama, T. Yoshinaga, S. Chow, H. Kurogi et al.: Genes, 9, 474 (2018).．研究プロジェクトは3年間であったが，初年度の解析で用いた日本の相模川と台湾で得られたシラスウナギ集団の間には定説通り，集団遺伝的な差異はなかった．しかし，その翌年に行った成魚を含めた解析に関しては，予想に反して熊本県の球磨川河口域で採集された集団に遺伝的差異が見つかった．従来単一集団であると考えられていたニホンウナギについて，遺伝的に明確に異なる亜集団が存在する可能性が示されたのだ．当初，輸入によって国内に持ち込まれたヨーロッパウナギやアメリカウナギの混入の可能性も指摘されたが，ミトコンドリアDNAによる種判別の結果，球磨川河口域で採集された個体はすべてニホンウナギであることが確認された．この亜集団のSNPを見てみると，集団を特徴づけるSNPはある特定の遺伝子上に存在するのではなく，ゲノム全体に幅広く分布していることが明らかとなった．すなわち，塩分，水温，および濁度など特定の環境を好むような遺伝的な自然選択圧は見受けられなかった．また，魚類では頭部に樹木の年輪のように輪紋が刻まれる耳石という組織が存在するが，この耳石による個体年齢の推定から4～8歳までの幅広い年齢の個体群であることが明らかとなった．したがって，球磨川河口域のニホンウナギの遺伝的差異は，単一世代内の環境に適応するための自然選択では無いと言える．また，主成分分析等の結果から，この亜集団はメイン集団と緩やかに交雑している可能性も示された．現状，これまで明らかになっているニホンウナギの生態モデルで，球磨川河口域の亜集団のような“部分集合のようなモザイク的分布”（図1図1■ニホンウナギの部分集合のような生殖隔離仮説）が存在する理由を明確に説明することは難しく，ニホンウナギに生殖隔離が存在するかどうかは未だ謎である．しかしながら，これらの研究から示唆される結果は，遺伝的集団構造を加味した分布や生態の再考を促す大きな手がかりになることが期待される．

図1■ニホンウナギの部分集合のような生殖隔離仮説

西マリアナ海嶺の産卵海域の中でも細分化された産卵場が存在し，その集団の一部が嗜好性や忌避行動により特定の亜集団を形成していると考えられる．我々はニホンウナギのこのような分布モデルを，reproductive isolation like subset mapping（RISM）モデルと名付けた．

ケーススタディー2．ヒルサシャッド（ヒルサ）

次に，自然選択により遺伝子型に選択圧がかかって遺伝的集団構造に差異が見られるケースを見てみよう．ヒルサ（Tenualosa ilisha）と言われてもピンとくる日本人なあまりいないであろう．ニシン科魚類のヒルサはインド，バングラデシュ，ミャンマーに囲まれるベンガル湾を中心とする北インド洋の海水域，河口などの汽水域，また淡水河川などの多様な生息地に分布し，サケ科魚類と同じく産卵期などに海から河川に入る溯河性魚類である⁽⁶⁾6) M. S. Hossain, S. M. Sharifuzzaman, S. R. Chowdhury & S. Sarker: Fish. Manag. Ecol., 23, 450 (2016).．非常に市場需要が大きく，世界の生産量のうちバングラデシュが全体の半分を占め，同国の「国魚」にも指定されている（図2図2■バングラデシュのフィッシュマーケットの風景）．なんと，ヒルサ漁業とその関連産業だけでバングラデシュの国内総生産（GDP）の1％近くの水準を担っているのである⁽⁷⁾7) S. Dutta, I. Al-Abri & S. Paul: Mar. Policy, 128, 104483 (2021).．近年，本種の生産量は，海洋漁獲量の増加により50万トン以上に達しているが，上流の淡水河川からの生産量は，遡上河川に建設されたダムによる生息地の改変や環境汚染，気候変動および幼魚の乱獲などの原因で驚くほど減少している．そのため，同国は禁漁期を設けたり10 cm以下の個体の漁を禁じたりするなど，持続可能な漁業のための様々な取り組みを行っている．ヒルサの資源を守るためには河川単位での保護が有効なのか？　はたまた，河川と海洋集団の包括的な管理が有効なのか？　広域な生息域を持つヒルサの資源を適切に管理するためにはやはり，集団構造の理解が必要である．そのため，我々はバングラデシュ現地の研究者と共同で海水域，汽水域および河川域など異なる9つの生息地で採集されたヒルサ野生集団のSNPマーカーに基づく遺伝的集団構造解析を試みた^{(8, 9)}8) M. Asaduzzaman, M. A. Wahab, M. J. Rahman, M. Nahiduzzzaman, M. W. Dickson, Y. Igarashi, S. Asakawa & L. L. Wong: Sci. Rep., 9, 16050 (2019).9) M. Asaduzzaman, Y. Igarashi, M. A. Wahab, M. Nahiduzzzaman, M. J. Rahman, M. J. Phillips, S. Huang, S. Asakawa, M. M. Rahman & L. L. Wong: Genes, 11, 46 (2020).．

図2■バングラデシュのフィッシュマーケットの風景

（A）漁獲されたヒルサ（B）活気あふれるマーケット（C）漁を終え休憩中の漁師たち．（写真撮影：Md. Asaduzzaman博士）．

ところで，このヒルサの解析にはNextRAD（nextera-tagmented RAD）sequencingという手法を用いた．NextRADはRAD-seqの亜種でSNPsaurus社が提供しているSNPジェノタイピングサービスである．現在，様々な企業がNGSのサービスを提供しているため，熟練のサンプル調製テクニックが無くともシーケンスやSNPジェノタイピングを行うことができるようになっている．これから始めるという研究者の方は，まずそのようなサービスを検討しても良いだろう．

話を戻すが，NextRADにより15,453箇所のSNPサイトを同定することができた．これらのSNPマーカーに基づく解析では，異なる環境から収集したすべての個体間で遺伝的差異が極めて低いか全く無いことが判明した．そこで，自然選択に対して中立ではないSNPに着目し，環境の選択圧がかかったSNPを抽出して解析したところ，海洋集団と河川集団に明確な遺伝的差異が認められた．つまり，本種の集団を特徴づけるSNPは生息域の塩分や濁度により選択圧が生じているSNPであり，自然選択により異なる遺伝的集団構造を示すことが明らかとなった．さらに，河川域集団も河川ごとに2つのサブグループを形成したことから，ヒルサは産卵のためにそれぞれの出生河川に戻る可能性が示唆された．これまでの報告によると，ヒルサの主集団は海洋と淡水域を回遊するといったライフサイクルを示すが，一部の集団は淡水域もしくは海洋域に留まるとされる．また，年齢によって産卵場も河川の河口域であるか上流域であるか違いが有るとされる⁽⁶⁾6) M. S. Hossain, S. M. Sharifuzzaman, S. R. Chowdhury & S. Sarker: Fish. Manag. Ecol., 23, 450 (2016).．したがって，このような生息地選択の違いがヒルサの海洋集団と河川集団の遺伝的集団構造に違いをもたらす要因であろう．これらの成果から，同国のヒルサは海洋集団と河川集団は個別の管理体制が必要であることが示され，ヒルサの適切な資源の管理法の提言および水産養殖業の発展に資する重要な知見が得られたと考えている．

ケーススタディー3．ウシエビ

最後に，野生型の集団と養殖個体の集団に遺伝的差異を見出したケースを紹介しよう．日本でもブラックタイガーという名称で親しまれているウシエビ（Penaeus monodon）は，国内外で商業的に非常に重要な水産養殖種の1つである．西日本，オーストラリア北岸，南アフリカ東岸まで，インド太平洋の熱帯・亜熱帯域に広く分布しており，アジア諸国での養殖が盛んで，国内への輸入量は全体で約15.5万トン，1740億円もの規模になり⁽¹⁰⁾10) 農林水産省：農林水産物輸出入統計／貿易統計（輸入），https://www.e-stat.go.jp/stat-search/files?page=1&layout=datalist&toukei=00500100&tstat=000001018079&cycle=7&year=20200&month=0&tclass1=000001018080, 2020.，日本市場に出回るほぼ全てのウシエビが養殖個体である．しかし一方で，エビの養殖業は現在様々な問題が指摘されており，例えば養殖場を作るために汽水域のマングローブ林を切り開くといった環境破壊や養殖場の排水による環境汚染問題．過密養殖による残餌や糞および溶存酸素の低下による水質汚染問題．ウイルス感染症対策の抗生物質や成長を促すホルモン投与などの薬品の使用や残留問題などが挙げられる⁽¹¹⁾11) FAO: Improving Penaeus monodon hatchery practices. Manual based on experience in India.: FAO Fish. Tech. Pap., 2007.．さらに，これらメジャーな問題に加え，長期的な種苗生産のための交配を行ってきたことで，卵質や稚エビの生存率の低下など，種苗生産性が低下しているという問題が表面化しつつある．そこで，我々はSNP解析に基づく野生および養殖個体群の遺伝的多様性を評価することを目的とし研究を行った⁽¹²⁾12) L. L. Wong, Z. M. Deris, Y. Igarashi, S. Huang, S. Asakawa, Q. Ayub, S. Y. Lim, M. Ikhwanuddin, S. Iehata, K. Okamoto et al.: Biology, 9, 277 (2020).．

解析には日本とマレーシアで採集された野生個体群およびマダガスカル，タイ，ハワイで採集された養殖個体群を試料として用いた．また，ここではSkimSeq（Skim sequencing）というSNPジェノタイピング手法を用いた．SkimSeqは，複雑なサンプル調製ステップが少なく，特定の対立遺伝子に対して偏りがなくSNPの検出が可能で，ゲノムを浅くシーケンスすることにより，低コストで多検体の処理を可能とするシーケンス手法である．このようなアプローチは，親のゲノム情報が不明な集団の研究において，詳細な多様性解析やマーカーアシスト選抜に有用であることが報告されている^{(13, 14)}13) X. Huang, Q. Feng, Q. Qian, Q. Zhao, L. Wang, A. Wang, J. Guan, D. Fan, Q. Weng, T. Huang et al.: Genome Res., 19, 1068 (2009).14) K. Gacek, P. Bayer, I. Bartkowiak-Broda, L. Szala, J. Bocianowski, D. Edwards & J. Batley: Front. Plant Sci., 7, 2062 (2017).．まず，ヒルサの事例と同様に，SkimSeqによりジェノタイピングされたSNPから自然選択圧のかかった環境適応的SNPを抽出すると，4,983個の環境適応的SNPが抽出された．これらの環境適応的SNPに基づき遺伝的集団構造解析を行うと，野生個体群と養殖個体群の間には顕著な遺伝的乖離が存在し，養殖個体群の遺伝的多様性は非常に低いことが示された（図3図3■ウシエビ集団より抽出されたSNPに基づくクラスター分析の結果）．さらに，これらのSNPについてBlast検索を用いて相同性検索を行った所，ゲノム上のコーディング領域上に存在して，アミノ酸に非同義置換を生じる50個のSNPが検出された．機能解析の結果，これらのSNPは呼吸，代謝，ミトコンドリアの酸化的リン酸化などの生理機能に関連しているSNPマーカーであったことから，養殖環境下での漁獲による人為的選択，過密飼育や水質の悪化等の環境ストレスによる選択圧の影響が示唆された．これらのSNPマーカーは，ウシエビ種苗の質と量を評価するための標準化された指標へと応用できる可能性があり，持続可能なウシエビ養殖・育種への貢献が期待される．

図3■ウシエビ集団より抽出されたSNPに基づくクラスター分析の結果

天然個体群のクラスターと養殖個体群のクラスターが明確に分岐している．また，天然個体群では，産地別にクラスターを形成しており，地域間の遺伝的多様性が高いことを示す．一方で，養殖個体群のクラスターは，産地ごとに明確なクラスターが存在せず，遺伝的多様性が低いことが示された．

おわりに

2003年に終了したヒトゲノムプロジェクトでは30億ドルという巨額予算を費やした．しかし，ヒトゲノムを解読するコストは劇的に低下し2010年には10,000ドル，2014年には1,000ドル，そして今や100ドルの壁を突破しようとアメリカのIllumina社や中国のBGI社がしのぎを削っており，まもなく100ドルゲノムの時代が訪れる．シーケンスコストの低下は多検体を同時に解析する集団構造解析においても非常に喜ばしいことである．NGS解析への敷居が低くなることで今後益々メジャーな生物種だけでなくマイナーな生物を対象にしたSNPを利用した解析が増え，これまで単一な集団であると考えられていた種でも集団構造についての新たな知見が見いだされる可能性がある．それらの知見は，生物の分類や生態への理解の大いに役立つだろう．また，現在，持続可能な漁獲や資源保護および資源管理は世界にとって重要な課題の1つであるであるが，広域な生息域を持つ水圏生物において，それらの水産資源は生物種により一元的に管理するのではなく，地域集団や系群ごとの特徴に合わせた管理が不可欠である．したがって，SNPに基づく水圏生物の詳細な遺伝的集団構造の理解，およびその知見の蓄積は，地域集団の遺伝的特性を加味した適切な資源管理に大いに貢献するものであると考えられる．