クオラムセンシング機構

グラム陰性細菌は一般的に，菌密度依存の遺伝子発現調節機構であるクオラムセンシング（QS）を使って，集団として統制のとれた行動をとることが知られている⁽²⁾2) M. B. Miller & B. L. Bassler: Annu. Rev. Microbiol., 55, 165 (2001).．グラム陰性細菌の多くはアシルホモセリンラクトン（AHL）型のQS機構を持つが，青枯病菌はRalstonia属を中心とした細菌種にしかない独自のQS機構を有しているのが特徴である⁽¹⁾1) S. Genin & T. P. Denny: Annu. Rev. Phytopathol., 50, 67 (2012).．青枯病菌のQS機構で中心的な役割を担うのは，グローバルビルレンスレギュレーターであるPhcAというタンパク質で，本因子は青枯病菌全遺伝子の約30％もの発現制御に関わることが知られている（図1図1■青枯病菌におけるphc QS機構のモデル）⁽³⁾3) A. Perrier, X. Barlet, R. Peyraud, D. Rengel, A. Guidot & S. Genin: Microb. Pathog., 116, 273 (2018).．このPhcAの活性化には，phcBSRQというオペロンによってコードされたタンパク質群が必要である．PhcBはメチル基転移酵素であり，前駆体脂肪酸からQSシグナル分子であるmethyl 3-hydroxymyristate（3-OH MAME, 1）を生合成する⁽⁴⁾4) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．菌株によっては，アシル鎖が長いmethyl 3-hydroxypalmitate（3-OH PAME, 2）をQSシグナル分子として利用しているものもある．PhcS–PhcRQは二成分情報伝達系を構成しており，PhcSは膜貫通型のヒスチジンキナーゼ，PhcRとPhcQは下流のレスポンスレギュレーターとして機能している．PhcRQからPhcAの活性化に至る経路は，未だにはっきりとしていない．我々は，青枯病菌のQS機構を「phc QS機構」と呼んでいる．

図1■青枯病菌におけるphc QS機構のモデル

青枯病菌は，QSシグナル分子として3-OH MAMEまたは3-OH PAMEを使用する．メチル基転移酵素PhcBは3-OH MAMEを合成し，それをヒスチジンキナーゼPhcSが感知する．シグナルを感知したPhcSはレスポンスレギュレーターPhcR/PhcQをリン酸化し，ビルレンスレギュレーターであるPhcAを活性化する．活性化されたPhcAは，EPS, 二次代謝産物，バイオフィルムなどの病原力因子の産生を誘導する．

青枯病菌は植物感染時の様々なステップでphc QS機構を上手く利用して，病原力因子や細胞特性を適時，発現・発揮していることがわかってきた⁽¹⁾1) S. Genin & T. P. Denny: Annu. Rev. Phytopathol., 50, 67 (2012).．実際，phcAやphcBを欠損させた株では，宿主植物に対する病原力が大幅に低下する⁽¹⁾1) S. Genin & T. P. Denny: Annu. Rev. Phytopathol., 50, 67 (2012).．QSが起動しないこれらの欠損株は，植物が備えている防御システムすらクリアできない軟弱なものになり，根に上手く侵入できなくなる場合が多い．積極的に傷処理した場合は，これらの欠損株でも根に侵入できるものの，地上部への移動はできなくなった⁽⁵⁾5) A. Yoshihara, M. Shimatani, M. Sakata, C. Takemura, W. Senuma, Y. Hikichi & K. Kai: ACS Chem. Biol., 15, 3050 (2020).．

植物保護に向けたQS阻害の取り組み

これまでに，AHL型のQS機構を中心として，QS阻害による細菌の病原力制御への取り組みがなされてきた．当初注目されたのは，AHL分解酵素を用いた方法である．AHLに対して高い分解活性を有する酵素を発見し，それを宿主植物に発現させるものである^{(6, 7)}6) Y. H. Dong, L. H. Wang, J. L. Xu, H. B. Zhang, X. F. Zhang & L. H. Zhang: Nature, 411, 813 (2001).7) Y. H. Dong, J. L. Xu, X. Z. Li & L. H. Zhang: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 3526 (2000).．素晴らしい効果が示されたが，組換え植物ということでコンセプトの段階に留まっており，同研究グループからの続報は20年以上ない．その後，精力的に研究が進められたのは，AHLの構造アナログを使ったケミカルなQS阻害である⁽⁸⁾8) W. R. D. Galloway, J. T. Hodgkinson, S. D. Bowden, M. Welch & D. R. Spring: Chem. Rev., 111, 28 (2011).．中には，特に強力な阻害活性を示し，植物体を用いた試験でも病原細菌の病原力を低下させることに成功した例もあった．現在も，世界各地で精力的にAHL型QS機構の阻害剤開発は進められている．

青枯病菌のphc QS機構に関しても，同じような流れで阻害研究が進展した．篠原らによって最初に見出された3-OH PAMEのエステラーゼは，in vitroの実験系でQS阻害効果を示した⁽⁹⁾9) M. Shinohara, N. Nakajima & Y. Uehara: J. Appl. Microbiol., 103, 152 (2007).．その後，海外のグループからも同じような酵素が報告されたが，in vivoでの検討は不十分であった^{(10, 11)}10) M. H. Lee, R. Khan, W. Tao, K. Choi, S. Y. Lee, J. W. Lee, E. C. Hwang & S. W. Lee: J. Biotechnol., 270, 30 (2018).11) G. A. Achari & R. Ramesh: Lett. Appl. Microbiol., 60, 447 (2015).．これらはケミカルによる青枯病の制御を補完する技術であり，一層の発展を期待して待ちたい．我々が今回紹介するPQI類（phc quorum sensing inhibitor）を報告した以降も，酵素を使った研究が何報かパブリッシュされているが，QS阻害剤としての検証が正しくなされていないため，それらの紹介は控えたい．

3-OH MAMEの構造活性相関研究とPhcSへの結合様式

我々が主に利用している野生株のOE1-1株は，国内の圃場より単離された青枯病菌であり，3-OH MAMEをQSシグナル分子として利用している（図1図1■青枯病菌におけるphc QS機構のモデル）⁽⁴⁾4) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．青枯病菌OE1-1株のQSシグナル分子として3-OH MAMEを同定したとき，簡単な構造活性相関研究を行った．その結果，（3R）-hydroxy基とメチルエステルが高いQSシグナル活性に必須であることがわかった．一方で，アシル鎖長に関しては，C₁₄が最も適していたものの，アシル鎖の伸長にはやや許容があることがわかった．C₁₂誘導体は不活性であった．意外なことではあったが，2位にヒドロキシ基を移動させても強いアゴニスト活性が見られた．

3-OH MAMEがどのようにPhcSに結合するのかに関しては，構造生物学的な知見はない．一方で，3-OH MAME型と3-OH PAME型のPhcSの配列比較からは，N末端側のセンサードメインのペリプラズムあるいは細胞質に突出した部分がリガンドの認識に関わる可能性が言われている⁽⁴⁾4) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．この点を考慮すれば，3-OH MAMEはエステル部分がPhcSタンパク質で厳密に認識され，アシル鎖側の認識はややあまいことが推察される．実際，3-OH MAMEの構造活性相関データとも良い一致を示す⁽⁴⁾4) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．まずは，リガンドの農薬としてのポテンシャル（安定性など）は考慮せずに，強いQS阻害剤を作ることを目指して，デザインのターゲットとして3-OH MAMEのアシル鎖の改変を考えることにした．

QS阻害剤の探索

AHL研究では，アシル鎖の部分にベンゼン環などの芳香環を入れるとアゴニスト活性を失い，アンタゴニストとして機能することが報告されている⁽⁸⁾8) W. R. D. Galloway, J. T. Hodgkinson, S. D. Bowden, M. Welch & D. R. Spring: Chem. Rev., 111, 28 (2011).．同じようなコンセプトを元に，3-OH MAMEのアシル鎖の構造を変化させた化合物を10種用意し，QS阻害活性を調べることにした（図2図2■phc QS依存性バイオフィルム形成に対する3-OH MAME類似体の阻害活性）⁽⁵⁾5) A. Yoshihara, M. Shimatani, M. Sakata, C. Takemura, W. Senuma, Y. Hikichi & K. Kai: ACS Chem. Biol., 15, 3050 (2020).．青枯病菌のバイオフィルム形成はQS制御下にあることが知られており，96穴のアッセイプレートが使えるため，ある程度のスループット性もある．1stスクリーニングということで100 μMとやや高い濃度でアッセイを行ったが，PQI-1と名付けた化合物6にバイオフィルム形成阻害活性があることが見出された．なお，PQI-1に青枯病菌に対する生育阻害効果は認められなかった．

図2■phc QS依存性バイオフィルム形成に対する3-OH MAME類似体の阻害活性

（A）1stスクリーニングに用いた3-OH MAMEアナログの構造．（B）3-OH MAMEアナログによるバイオフィルム形成の阻害．アナログは終濃度100 μMで用いた．形成されたバイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色し，595 nmの吸光度で評価した．∆phcBは，ポジティブコントロールとして使用した．エラーバーは平均±SDである（n＝5）．

そこでPQI-1をベースに，さらにQS阻害能が向上した化合物を創製することを目指した．具体的には，ベンゼン環と3-ヒドロキシメチルエステル構造を繋ぐアシル鎖長を変化させたもの，ベンゼン環上にハロゲンやメチル基などを導入したもの，これらを掛け合わせたものをデザイン・化学合成した（図3A図3■phc QS依存性バイオフィルム形成に対するPQI-1アナログの阻害活性）⁽⁵⁾5) A. Yoshihara, M. Shimatani, M. Sakata, C. Takemura, W. Senuma, Y. Hikichi & K. Kai: ACS Chem. Biol., 15, 3050 (2020).．加えて，阻害活性が強いことがわかった化合物については，2-ヒドロキシ型のアナログもデザイン・化学合成した．合計23化合物について，バイオフィルム形成阻害試験に供した．

図3■phc QS依存性バイオフィルム形成に対するPQI-1アナログの阻害活性

（A）2ndスクリーニングに用いたPQI-1アナログの構造．（B）PQI-1アナログ（1 μM）存在下でのOE1-1株によるバイオフィルム形成の阻害．∆phcBは，ポジティブコントロールとして用いた．（C）OE1-1株の生育に対するPQI-1アナログ（1 μM）の影響．エラーバーは平均±SD（n＝5）である．

化合物15および18～20の結果から，ベンゼン環のパラ位へのハロゲン（特にCl）基またはメチル基の導入はOE1-1株のバイオフィルム形成の抑制に有効であることが示唆された（図3B図3■phc QS依存性バイオフィルム形成に対するPQI-1アナログの阻害活性）．7-Phenyl-heptanoyl鎖を有する化合物は，異なるアシル鎖長（13～16, 17と18, 20と21）を有する誘導体の中で最も高い阻害活性を示した．また，2-ヒドロキシ型の化合物32と化合物35のQS阻害活性は予想通り高かった．これらを1 μMで適用すると，菌株のバイオフィルム形成が抑制され，OE1-1株のバイオフィルム形成を∆phcBのレベルまで減少させた．2-ヒドロキシ型の最適なアシル鎖長は，3-ヒドロキシ型と同じであった（32と33, 34と35）．これらのQS阻害剤は，OE1-1株の増殖を有意に阻害しなかった（図3C図3■phc QS依存性バイオフィルム形成に対するPQI-1アナログの阻害活性）．したがって，バイオフィルム形成の阻害は，細菌の生育阻害に起因するものではないことがわかった．我々は，さらなる実験のために化合物15, 32, 20および35を選択し，それらをPQI-2～5と命名した（図3B図3■phc QS依存性バイオフィルム形成に対するPQI-1アナログの阻害活性）．

PQIのQS阻害活性は立体特異的である

3-OH MAMEのQSシグナル活性は，C-3オキシメチンの絶対立体配置に依存する⁽⁴⁾4) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．したがって，我々はQS阻害活性の立体特異性がPQIにも存在すると仮定し，キラルカラムを用いたHPLC分離によりPQI-2～5の光学分割を行った．立体異性体の絶対立体配置は，既報の構造関連化合物の［α］^D値と比較することにより決定した．PQI-2とPQI-4のR体は，S体よりも高い阻害活性を示した（図4図4■バイオフィルム形成に対する光学分割後のPQI類の阻害活性）⁽⁵⁾5) A. Yoshihara, M. Shimatani, M. Sakata, C. Takemura, W. Senuma, Y. Hikichi & K. Kai: ACS Chem. Biol., 15, 3050 (2020).．それぞれのIC₅₀値は，（R）-PQI-2は278 nM, （R）-PQI-4は196 nM, （S）-PQI-2は26.3 μM, （S）-PQI-4は2.73 μMであった．一方，PQI-3とPQI-5のS体は，R体よりも高い阻害活性を示した．それぞれの阻害活性のIC₅₀値は，（S）-PQI-3は119 nM, （S）-PQI-5は41.2 nM, （R）-PQI-3は731 μM, （R）-PQI-5は16.1 μMであった．興味深いことに，2-ヒドロキシ型の方が3-ヒドロキシ型よりも厳密な立体特異性を示した．また，QS阻害活性を示す濃度域において，PQI-2～5によるOE1-1株の生育阻害がないことを確認した．PQIのC-2/C-3位の絶対配置はQS阻害活性を左右する重要な因子であることが明らかとなり，より強いエナンチオマーを以降のin vitro実験に使用した．

図4■バイオフィルム形成に対する光学分割後のPQI類の阻害活性

（A）（R）-と（S）-PQI-2によるOE1-1バイオフィルム形成の阻害（B）（R）-と（S）-PQI-4によるOE1-1バイオフィルム形成の阻害．（C）（R）-と（S）-PQI-3によるOE1-1バイオフィルム形成の阻害．（D）（R）-と（S）-PQI-5によるOE1-1バイオフィルム形成の阻害．∆phcBはポジティブコントロールである．エラーバーは平均±SD（n＝5）である．

PQIは他の病原力因子の産生も阻害する

アリールフラノン型の二次代謝物であるralfuranone類は，二次的な細胞間シグナルとして機能し，OE1-1株の病原力発現に関与している⁽¹²⁾12) K. Kai, H. Ohnishi, Y. Mori, A. Kiba, K. Ohnishi & Y. Hikichi: ChemBioChem, 15, 2590 (2014).．その生合成遺伝子であるralAとralDの発現は，phc QSによって制御されている．そのため，∆phcBはこれらの代謝物を生産しない．もしPQI-2～5がphc QSシステムに対するQS阻害剤として働くなら，OE1-1株におけるralfunone類の生産が阻害されるはずである．これを検証するために，我々は高感度スループット定量法を構築し，PQI-2～5がralfuranone生産に及ぼす影響を評価した．その結果，PQI-2～5は，OE1-1株によるralfuranone Aの生産を用量依存的に阻害した（図5A図5■PQI-2～5のphc QS阻害剤としての評価）⁽⁵⁾5) A. Yoshihara, M. Shimatani, M. Sakata, C. Takemura, W. Senuma, Y. Hikichi & K. Kai: ACS Chem. Biol., 15, 3050 (2020).．また，（R）-PQI-2～5のIC₅₀値は，それぞれ23.7, 1.01, 2.33, 0.966 μMであった．PQI-2は低濃度域でralfuranone Aの生産を促進したことから，部分的なアゴニスト活性を有している可能があった．（S）-PQI-3と（S）-PQI-5は，3-ヒドロキシ型化合物よりも高いralfuranone生産抑制効果を示した．