ゲノム編集技術とは？

ゲノム編集は，内在性の遺伝子の塩基配列を変化させる技術であるが，大きく分けて二つの技術がある（図1図1■ゲノム編集の主な2つの技術の概略図）．一つは，CRISPR/Cas9などの人工制限酵素で標的遺伝子上にDNA二重鎖切断（DSBs）を誘発し，DSBの末端が再結合される修復（非相同末端結合）の過程で生じるエラーを利用して標的遺伝子に挿入・欠失変異などを導入する「標的変異」技術（図1A図1■ゲノム編集の主な2つの技術の概略図）である．この技術は修復エラーを利用して変異を導入することから，変異パターンを制御することはできず，主に機能欠損型変異体の作出に用いられている．既に様々な植物種に適用されており^{(2, 3)}2) X. Ma, Q. Zhu, Y. Chen & Y.-G. Liu: Mol. Plant, 9, 961 (2016).3) L. Arora & A. Narula: Front. Plant Sci., 8, 1932 (2017).，日本国内でもこの技術で作出された健康機能性成分を高濃度で含むトマト⁽⁴⁾4) S. Nonaka, C. Arai, M. Takayama, C. Matsukura & H. Ezura: Sci. Rep., 7, 7057 (2017).が販売されている．もう一つの技術は，「標的組換え（ジーンターゲッティング，GT）」技術（図1B図1■ゲノム編集の主な2つの技術の概略図）であり，標的遺伝子上に生じたDSBsを相同組換え経路により修復する過程で，外来DNA（相同組換えの鋳型DNA）として導入した配列をコピーペーストするため，任意の変異（アミノ酸置換，ドメイン交換，ノックインなど）を標的遺伝子に導入することが可能である．機能獲得型の変異体作出には不可欠な技術であるが，高等植物では相同組換え頻度が低いためGT効率が非常に低く^{(5, 6)}5) M. Hrouda & J. Paszkowski: Mol. Gen. Genet., 243, 106 (1994).6) R. Offringa, M. J. de Groot, H. J. Haagsman, M. P. Does, P. J. van den Elzen & P. J. Hooykaas: EMBO J., 9, 3077 (1990).，様々な方面からその効率化に取り組まれてきた．

図1■ゲノム編集の主な2つの技術の概略図

A．人工制限酵素により誘発したDSBsを修復する過程で生じるエラーを利用して標的遺伝子を主に壊す技術．B．任意の変異（☆）を挿入した鋳型DNAを細胞内に導入し，その配列を相同組換え修復により標的遺伝子にコピーペーストする．

稀なGT細胞を効率良く選抜する方法の開発

前述のとおり，GTは標的遺伝子上に生じたDSBsを外来DNAを鋳型とした相同組換えにより修復する際に任意の改変を導入する技術であるが，高等植物では一般的に非相同末端結合経路が相同組換えよりも優先的に機能しており，生じたDSBsを即座に再結合させるためにGT効率は低いと考えられている．また，細胞内で自然発生的に生じるDSBsを利用する場合，標的遺伝子上よりもその他の領域でランダムに生じるDSBsが圧倒的に多く，細胞内に導入した相同組換えの鋳型DNA（外来DNA）は標的遺伝子以外の領域に非相同末端結合経路によりランダムに取り込まれる，いわゆる通常の形質転換イベントが多数生じてしまう．そのため，GTに成功する細胞の割合は，形質転換細胞の10⁻⁴から10⁻⁶と非常に低くなると考えられている^(5～8)5) M. Hrouda & J. Paszkowski: Mol. Gen. Genet., 243, 106 (1994).6) R. Offringa, M. J. de Groot, H. J. Haagsman, M. P. Does, P. J. van den Elzen & P. J. Hooykaas: EMBO J., 9, 3077 (1990).7) M. E. Gallego, P. Sirand-Pugnet & C. I. White: Plant Mol. Biol., 39, 83 (1999).8) H. Puchta: Plant Mol. Biol., 48, 173 (2002).．そこで，極めて稀なGT細胞を効率良く選抜する方法が開発されてきた．

1. ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したGT

ポジティブ・ネガティブ選抜法は，ポジティブ選抜マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を相同組換えの鋳型配列の内部に，ネガティブ選抜マーカー（致死あるいは生育阻害遺伝子など）を鋳型配列の外側に配置したGTベクター（図2図2■ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したGTと痕跡を残さないマーカー除去法の組み合わせによる精緻な標的遺伝子改変, Step1）を用いることで，ベクターがランダムにゲノムに挿入された細胞はネガティブ選抜マーカーの発現によって排除され，相同組換えによって標的遺伝子が改変された細胞はポジティブ選抜マーカーの発現によって効率良く濃縮される選抜法である．この選抜法は，Teradaら⁽⁹⁾9) R. Terada, H. Urawa, Y. Inagaki, K. Tsugane & S. Iida: Nat. Biotechnol., 20, 1030 (2002).によってイネにおけるGT細胞の選抜に適用され，ポジティブ選抜マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycin phosphotransferase; hpt），ネガティブ選抜マーカーとしてジフテリア毒素タンパクAフラグメント（diphtheria toxin A fragment; DT-A）を用いてイネにおいては再現性の高いGT系として確立されてきた^(10～13)10) R. Terada, Y. Johzuka-Hisatomi, M. Saitoh, H. Asao & S. Iida: Plant Physiol., 144, 846 (2007).11) A. Ono, K. Yamaguchi, S. Fukada-Tanaka, R. Terada, T. Mitsui & S. Iida: Plant J., 71, 564 (2012).12) T. Yamauchi, Y. Johzuka-Hisatomi, S. Fukada-Tanaka, R. Terada, I. Nakamura & S. Iida: Plant J., 60, 386 (2009).13) T. Yamauchi, Y. Johzuka-Hisatomi, R. Terada, I. Nakamura & S. Iida: Plant Mol. Biol., 85, 219 (2014).．しかしながら，DT-Aはタンパク質そのものが毒性を持ち，ベクターからの一過的発現により細胞毒性を示すなどの理由から，未だイネ以外の植物種には適用されていない．

図2■ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したGTと痕跡を残さないマーカー除去法の組み合わせによる精緻な標的遺伝子改変

A．制限酵素によるDSBsの誘導と単鎖アニーリング修復によるマーカー除去法の利用．Step1．アグロバクテリウムを介してGTベクターをイネカルスに導入し，ポジティブ・ネガティブ選抜によりGT細胞を濃縮する．GTの鋳型配列を部分的に重複（反復）させ，その内側に制限酵素などの認識配列（青矢印）を配置する．Step2．GTが成功した細胞において制限酵素を発現させてDSBsを誘発し，DNA修復により反復配列が単一の配列に再構成する過程でマーカーを除去して目的の変異（☆）のみを残す．B．piggyBacトランスポゾンの転移によるマーカー除去法の利用．Step1．アグロバクテリウムを介してGTベクターをイネカルスに導入し，ポジティブ・ネガティブ選抜によりGT細胞を濃縮する．ポジティブ選抜マーカーをpiggyBacトランスポゾンの内部に配置する．Step2．GTが成功した細胞においてpiggyBac転移酵素（PBase）を発現させ，piggyBacトランスポゾンの転移によりマーカーを除去し，目的の変異（☆）のみを残す．piggyBacの転移にはTTAA配列が必要である．いずれのマーカー除去法においても，次世代において標的遺伝子に目的の変異をホモで持ち，制限酵素あるいはPBase発現カセットを持たない個体を選抜する必要がある．

図3■all-in-oneGTベクターを用いたCRISPR/Cas9による標的変異誘導的なGT系

GT鋳型DNA配列，CRISPR/Cas9（gRNA, Cas9）発現カセット，選抜マーカーを一つのT-DNAに配置したall-in-one GTベクターを植物細胞に導入し，形質転換細胞の選抜の過程でCRISPR/Cas9による標的切断が生じる．その多くは非相同末端結合による修復エラーで欠損や挿入変異が生じるが，ごく稀にゲノムに挿入されたベクター上の鋳型配列を利用した相同組換え修復が生じ，目的の変異（☆印）が標的遺伝子に挿入される．

そこで筆者は，汎用的なポジティブ・ネガティブ選抜法の確立を目指して，選抜の開始時期や強度を任意に調節することができる条件的ネガティブ選抜マーカーの開発にも取り組んできた．その一つとして，ポジティブ選抜マーカーの発現をネガティブ選抜マーカーの発現で抑制するポジティブ・ネガティブ選抜法を考案した．より汎用的な選抜系となるように，多くの植物種において利用されているnptII（Neomycin phosphotransferase II）遺伝子をポジティブ選抜マーカーとして利用し，その発現を抑制するアンチセンス鎖（anti-nptII）をネガティブ選抜マーカーとした．実際に，この選抜法を用いて，イネの複数の内在遺伝子のGTによる改変に成功した⁽¹⁴⁾14) A. Nishizawa-Yokoi, S. Nonaka, K. Osakabe, H. Saika & S. Toki: Plant Physiol., 169, 362 (2015).．現在筆者らは，より強力な条件的ネガティブ選抜マーカーを開発し，イネ以外の植物種におけるGT細胞の選抜に適用することを試みている．

人工制限酵素を利用した標的切断誘導的なGTの開発

ゲノム上の任意の部位を切断できる制限酵素として，人工制限酵素の開発が進められてきた．第一世代のZinc Finger Nucleases（ZFNs）⁽²⁰20) Y. G. Kim, J. Cha & S. Chandrasegaran: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1156 (1996).⁾，第二世代のTranscription Activator-like Effector Nucleases（TALENs）⁽²¹⁾21) M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle, C. Schmidt, F. Zhang, A. Hummel, A. J. Bogdanove & D. F. Voytas: Genetics, 186, 757 (2010).，第三世代のCRISPR/Cas9^{(22, 23)}22) L. Cong, F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P. D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L. A. Marraffini et al.: Science, 339, 819 (2013).23) P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville & G. M. Church: Science, 339, 823 (2013).が人工制限酵素として開発されており，特にCRISPR/Cas9が開発されて以降は，様々な生物種においてゲノム中の狙った箇所にDSBsを誘発することが容易になった．

相同組換えを介したGTは標的遺伝子上にDSBsが生じることが引き金となることから，標的遺伝子上にDSBsを誘導することでGT効率は飛躍的に向上すると考えられている．そのため，CRISPR/Cas9による標的切断の誘導と同時に相同組換えの鋳型配列を細胞内に導入するGT系（標的切断誘導的GT）が様々な植物種において確立された⁽²⁴⁾24) D. Miki, R. Wang, J. Li, D. Kong, L. Zhang & J.-K. Zhu: Plant Cell Physiol., 62, 752 (2021).．その一つが，in-planta GTと呼ばれる方法で，両端に人工制限酵素の認識配列を配置したGTの鋳型配列と人工制限酵素発現カセットをゲノムに形質転換し，標的遺伝子の切断と鋳型配列の切り出しを同時に生じさせることで効率良くGTが生じる⁽²⁵⁾25) F. Fauser, N. Roth, M. Pacher, G. Ilg, R. Sanchez-Fernandez, C. Biesgen & H. Puchta: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 7535 (2012).．この方法は，シロイヌナズナにおける再現性のあるGT系として初めて確立された．また，卵細胞特異的プロモーターで人工制限酵素を発現させること⁽²⁶⁾26) F. Wolter, J. Klemm & H. Puchta: Plant J., 94, 735 (2018).や人工制限酵素の発現系の改良⁽²⁶⁾26) F. Wolter, J. Klemm & H. Puchta: Plant J., 94, 735 (2018).，DSBを誘導する際に突出末端を生じるCas12a^{(27, 28)}27) P. Schindele, L. Merker, T. Schreiber, A. Prange, A. Tissier & H. Puchta: Plant Biotechnol. J., in press.28) F. Wolter & H. Puchta: Plant J., 100, 1083 (2019).やCas9のpaired-nickase⁽²⁹⁾29) S. Schiml, F. Fauser & H. Puchta: Plant J., 80, 1139 (2014).を利用すること，非相同末端結合経路関連遺伝子の欠損変異体を利用すること⁽³⁰⁾30) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Physiol., 170, 667 (2016).でGT効率を改善し，in-planta GTによるイネ⁽³⁰⁾30) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Physiol., 170, 667 (2016).やタバコ⁽³¹⁾31) T.-K. Huang, B. Armstrong, P. Schindele & H. Puchta: Plant Biotechnol. J., 19, 1314 (2021).の内在性遺伝子の成功例も報告された．

筆者らのグループも，イネにおいて標的切断誘導を利用したGT効率の確立を試みてきた．簡便な標的切断誘導的なGT系として，標的遺伝子を切断する人工制限酵素発現カセットとGTの鋳型DNA配列，形質転換細胞を選抜するための選抜マーカーを同一のベクター上に配置したall-in-one GTベクターを利用することで，形質転換細胞の選抜過程で標的切断が生じ，ゲノム上に挿入されたT-DNA上の鋳型配列を切り出すことなく標的遺伝子の相同組換えによる修復が生じてGTが成立することを明らかにしている⁽³²⁾32) A. Nishizawa-Yokoi, M. Mikami & S. Toki: Front. Genome Editing, 2, 604289 (2020).．またこの時のGT効率は，形質転換細胞を相同組換えの活性化剤で処理することで限定的ながらも向上することを見出し，イネだけでなくタバコにおいてもGTによる内在性遺伝子の改変に成功した⁽³²⁾32) A. Nishizawa-Yokoi, M. Mikami & S. Toki: Front. Genome Editing, 2, 604289 (2020).．All-in-one GTベクターを利用した標的切断誘導的なGT系は，シロイヌナズナ^{(33, 34)}33) N. V. Permyakova, T. V. Marenkova, P. A. Belavin, A. A. Zagorskaya, Y. V. Sidorchuk, E. A. Uvarova, V. V. Kuznetsov, S. M. Rozov & E. V. Deineko: Cells, 10, 2137 (2021).34) Z. Zhengjing, Z. Wenjie, Z. Wenxin, L. Jing, K. Dali, Z. Lei, W. Rui, P. Fangnan, K. Zhe, K. Yongping et al.: Plant Physiol., 190, 2203 (2022).にも適用されている．

本項で述べたように，相同組換え経路と競合して機能する非相同末端結合経路の変異体⁽³²⁾32) A. Nishizawa-Yokoi, M. Mikami & S. Toki: Front. Genome Editing, 2, 604289 (2020).や阻害剤⁽³⁵⁾35) T. V. Vu, D. T. H. Doan, M. T. Tran, Y. W. Sung, Y. J. Song & J.-Y. Kim: Front. Plant Sci., 12, 722552 (2021).の利用，相同組換え活性化剤処理⁽³¹⁾31) T.-K. Huang, B. Armstrong, P. Schindele & H. Puchta: Plant Biotechnol. J., 19, 1314 (2021).により，GT効率は向上することが明らかになっている．さらに筆者らのグループは，イネにおいて標的切断と同時に相同組換え関連因子であるexonuclease 1やRecQ helicaseの1つのRecQl4を単独あるいは両方を過剰発現させることで，相同組換え効率が相乗的に増加することを示している⁽³⁶⁾36) Y. I. Kwon, K. Abe, K. Osakabe, M. Endo, A. Nishizawa-Yokoi, H. Saika, H. Shimada & S. Toki: Plant Cell Physiol., 53, 2142 (2012).．また，非相同末端結合経路のDSB末端保護に機能するKu70, Ku80あるいはDNA ligase Lig4の発現を抑制させたイネでは，T-DNAのゲノムへの挿入が抑制され，相同組換え効率の向上が見られることも明らかにしている⁽³⁷⁾37) A. Nishizawa-Yokoi, S. Nonaka, H. Saika, Y. I. Kwon, K. Osakabe & S. Toki: New Phytol., 196, 1048 (2012).．さらに最近，非相同末端結合のバックアップ経路で機能するDNA polymerase θ（PolQ）がT-DNA挿入やDNA修復に重要な役割を果たしていることを明らかにした⁽³⁸⁾38) A. Nishizawa-Yokoi, H. Saika, N. Hara, L. Y. Lee, S. Toki & S. B. Gelvin: New Phytol., 299, 2859 (2020).．現在，非相同末端結合経路の阻害剤や相同組換え活性化剤の利用によりDNA修復経路の調節し，GT効率をさらに向上させることに取り組んでいる．

相同組換えの鋳型DNAデリバリーの効率化によるGT効率の改良

前項で紹介したCRISPR/Cas9などの人工制限酵素を用いた標的切断誘導的なGT系は様々な植物種において適用されてきたが，より広範な植物種に適用させるために更なる効率化が試みられてきた．その一つのアプローチとして，標的遺伝子を切断するタイミングでGTの鋳型DNAを多量に複製させる（ウイルスベクターの利用），あるいは，標的遺伝子付近に効率的にデリバリーさせる（DNA切断部位への鋳型DNAデリバリー）実験系が確立されてきた．

GTを用いた精密ゲノム編集によるカスタムメイド改変の汎用化に向けて

近年，DSBを伴わないゲノム編集技術として，塩基置換を導入できるBase editor^{(52, 53)}52) K. Nishida, T. Arazoe, N. Yachie, S. Banno, M. Kakimoto, M. Tabata, M. Mochizuki, A. Miyabe, M. Araki, Y. H. Kiyotaka et al.: Science, 353, 1248 (2016).53) N. M. Gaudelli, A. C. Komor, H. A. Rees, M. S. Packer, A. H. Badran, D. I. Bryson & D. R. Liu: Nature, 551, 464 (2017).やRNAを鋳型に逆転写反応で短い任意の改変を導入できるPrime editing（コラムを参照）⁽⁵⁴⁾54) A. V. Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis, A. A. Sousa, L. W. Koblan, J. M. Levy, P. J. Chen, C. Wilson, G. A. Newby, A. Raguram et al.: Nature, 576, 149 (2019).が開発され，植物にも適用されている．これらの技術は精密なゲノム編集が可能であるが，塩基置換の方向性や変異を導入できる部位，導入可能な改変の大きさなどに制限があり，あらゆる任意の改変を導入できる技術はGTの他にないのが現状である．これまでのGTによる植物の精密ゲノム編集の報告では，転写因子の活性制御に関わるリン酸化部位の改変⁽¹⁹⁾19) A. Nishizawa-Yokoi, R. Motoyama, T. Tanaka, A. Mori, K. Iida & S. Toki: Plant Physiol., in press.，レポーター遺伝子のノックイン^{(11, 12, 19)}11) A. Ono, K. Yamaguchi, S. Fukada-Tanaka, R. Terada, T. Mitsui & S. Iida: Plant J., 71, 564 (2012).12) T. Yamauchi, Y. Johzuka-Hisatomi, S. Fukada-Tanaka, R. Terada, I. Nakamura & S. Iida: Plant J., 60, 386 (2009).19) A. Nishizawa-Yokoi, R. Motoyama, T. Tanaka, A. Mori, K. Iida & S. Toki: Plant Physiol., in press.，タグ配列のノックイン，遺伝子コード領域のスワッピングなど（Unpublished），植物の生命現象の分子機構解明への貢献だけでなく，アミノ酸置換による除草剤耐性の付与や代謝経路の改変^{(9, 14, 15, 18, 28, 30, 32)}9) R. Terada, H. Urawa, Y. Inagaki, K. Tsugane & S. Iida: Nat. Biotechnol., 20, 1030 (2002).14) A. Nishizawa-Yokoi, S. Nonaka, K. Osakabe, H. Saika & S. Toki: Plant Physiol., 169, 362 (2015).15) M. Endo, S. Iwakami & S. Toki: Plant Biotechnol. J., 19, 563 (2020).18) A. Nishizawa-Yokoi, M. Endo, N. Ohtsuki, H. Saika & S. Toki: Plant J., 81, 160 (2015).28) F. Wolter & H. Puchta: Plant J., 100, 1083 (2019).30) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Physiol., 170, 667 (2016).32) A. Nishizawa-Yokoi, M. Mikami & S. Toki: Front. Genome Editing, 2, 604289 (2020).，micro RNA標的部位の改変による閉花性の付与⁽¹⁶⁾16) N. Ohtsuki, K. Kizawa, A. Mori, A. Nishizawa-Yokoi, T. Komatsuda, H. Yoshida, K. Hayakawa, S. Toki & H. Saika: Front. Genome Editing, 2, 617713 (2021).，プロモータースワップによる収量増加⁽⁵⁵⁾55) J. Shi, H. Gao, H. Wang, H. R. Lafitte, R. L. Archibald, M. Yang, S. M. Hakimi, H. Mo & J. E. Habben: Plant Biotechnol. J., 15, 207 (2017).など，種々の優良な農業形質を付与することに成功している．さらに最近，CRISPR/Cas9を介したDSBsの誘導が体細胞における相同染色体間の組換えを生じさせることがシロイヌナズナ⁽⁵⁶⁾56) S. Filler-Hayut, K. Kniazev, C. Melamed-Bessudo & A. A. Levy: Int. J. Mol. Sci., 22, 12096 (2021).やトマト^{(57, 58)}57) S. Filler-Hayut, C. Melamed Bessudo & A. A. Levy: Nat. Commun., 8, 15605 (2017).58) I. Ben Shlush, A. Samach, C. Melamed-Bessudo, D. Ben-Tov, T. Dahan-Meir, S. Filler-Hayut & A. A. Levy: Genes, 12, 59 (2021).で明らかになっており，交配育種の精密化に貢献することが期待される．今後，本稿で紹介した技術をさらに効率化させて様々な植物種に適用可能なGT系を確立し，希望する植物種で標的の遺伝子を狙い通りに改変できるカスタムメイド変異創出を可能にし，植物科学の発展と作物育種の加速化の両方に貢献したい．