1. モデル木材腐朽菌における植物細胞壁成分の認識・分解機構について

木材腐朽菌は培地中のセルロースの分解物を認識することでセルロース分解酵素を生産することが知られていた．しかし，セルロース以外の多糖類に対する認識・応答機構についてはほとんど報告がなかった．そこで筆者らは，木材腐朽のモデル菌としてリグノセルロース分解能力が高く，全ゲノム情報が開示されているPhanerochaete chrysosporiumを対象に，代表的な多糖類であるデンプンおよびキシランに対する応答を解析した．具体的には，セルロース培地に，キシランおよびデンプンを添加した場合におけるモデル腐朽菌の酵素生産に与える影響を比較した．その結果，デンプン添加は酵素生産量を約1/2に抑制する一方で，キシラン添加は酵素生産量を約2倍に促進することを見出した．この結果から，分解しやすいデンプンを添加することによって生じたグルコースが優先的に資化され，セルロースを資化せずとも十分なエネルギーがあるため，セルロース分解関連酵素の生産が抑制されたと考えられた．このような代謝生成物のグルコースなどによって上流の酵素生産を抑制するカタボライトリプレッションが生じたと予想された．他方，キシランを添加した場合はキシラン分解物は栄養源とはならず，キシラン分解酵素と共に新規のセルロース分解関連酵素の生産を促進すること明らかにした⁽¹⁾1) C. Hori, K. Igarashi, A. Katayama & M. Samejima: FEMS Microbiol. Lett., 321, 14 (2011).．これはキシラン分解物が栄養源となるセルロースの存在を示唆するシグナル分子の役割を果たしていると考えられた．そこで次に，腐朽菌がキシラン分解物のどのような成分を認識しているのかという課題に取り組んだ．重合度1～4のキシロオリゴ糖や，対象実験としてセロオリゴ糖に対するセルロース分解関連酵素遺伝子の発現応答解析を行ったところ，セロオリゴ糖とキシロオリゴ糖といった構成糖に加え，添加したオリゴ糖の重合度毎に生産される酵素が異なっていた．即ち，腐朽菌は重合度の違うオリゴ糖を異なるシグナル分子として認識することで，セルロースやキシラン分解酵素生産をコントロールし，植物細胞壁上のキシラン・セルロース層を順番に効率よく分解する機構を保有していることが明らかになった⁽²⁾2) C. Hori, H. Suzuki, K. Igarashi & M. Samejima: Appl. Environ. Microbiol., 78, 3770 (2012).．

2. 腐朽菌における多様な植物分解機構について

2004年にモデル腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumの全ゲノム配列情報が開示されプロテオーム解析が可能になると，それまで主要な酵素を一つずつ単離していた頃には予想できない程様々な酵素が協調して植物分解を進めている可能性が示唆された^{(3, 4)}3) D. Martinez, L. F. Larrondo, N. Putnam, M. D. S. Gelpke, K. Huang, J. Chapman, K. G. Hefenbein, P. Ramaiya, J. C. Detter, F. Larimer et al.: Nat. Biotechnol., 22, 695 (2004).4) A. Wymelengerg, G. Sabat, D. Martinez, A. S. Rajangam, T. T. Teeri, J. Gaskell, P. J. Kersten & D. Cullen: J. Biotechnol., 118, 17 (2005).．そこで，腐朽菌における多様な植物分解機構を明らかにするために，腐朽菌として大別される白色腐朽菌と褐色腐朽菌の分解機構解明に国際共同研究体制で取り組んだ．白色腐朽菌は，セルロース・ヘミセルロース・リグニン全てを分解することができる一方，褐色腐朽菌はセルロース・ヘミセルロースといった多糖のみを分解する事が知られていたが，この分解形態の違いをゲノムレベルで解析するため，糖質関連酵素データ（Carbohydrate-active enzymes; CAZymes）に分類される植物細胞壁分解酵素をコードする遺伝子を解析する試みが行われた．その結果，当初の予想通りリグニン分解に関与するリグニンペルオキシダーゼやマンガンペルオキシダーゼなどの真菌由来分泌型クラスIIペルオキシダーゼ（PODII）が褐色腐朽菌には欠損していた⁽⁵⁾5) D. Floudas, M. Binder, R. Riley, K. Barry, R. A. Blanchette, B. Henrissat, A. T. Martínez, R. Otillar, J. W. Spatafora, J. S. Yadav et al.: Science, 236, 1715 (2012).．さらに，セルロースやヘミセルロースの分解に関与するセルラーゼやヘミセルラーゼに付与されているセルロース吸着モジュールファミリー1（CBM1）も褐色腐朽菌は欠損していることが明らかになった．しかし木材腐朽菌は担子菌の分類の中でも多くの目にまたがって分布しており，それ以上の統一した見解は得られなかった．そこで筆者らは，分解能力が高いハラタケ目に属する11種の白色腐朽菌および褐色腐朽菌を対象に比較ゲノム・プロテオーム解析を実施した．その結果，白色腐朽菌はセルロースやヘミセルロースを分解する加水分解酵素や酸化還元酵素をコードする多様な遺伝子を保持する一方で，褐色腐朽菌はそれら酵素をコードする遺伝子の数が非常に少なかった（もしくは保有していなかった）．即ち，白色腐朽菌は，多糖に含まれる様々な結合を特異的に分解する加水分解酵素や酸化還元酵素を獲得した結果，多様な酵素群を協調的に生産することで効率的なセルロース・ヘミセルロース・リグニン分解を行っていることが明らかになった．一方で，褐色腐朽菌は一部の特異性の広いエンド型セルラーゼ・ヘミセルラーゼを利用しており，また，フェントン反応に利用される還元された鉄イオンを供給するとされるキノン還元酵素を利用していた⁽⁶⁾6) C. Hori, J. Gaskel, K. Igarashi, M. Samejima, D. Hibbett, B. Henrissat & D. Cullen: Mycologia, 105, 1412 (2013).．このことは，進化的に白色腐朽菌より後に出現した褐色腐朽菌が，多様な酵素群の代わりにフェントン反応を介してラジカルを生成させ，非特異的に多糖類やリグニンを効率よく分解する戦略を選択したことを示している．

以上の白色・褐色腐朽菌の腐朽機構の違いに加え，木材腐朽菌には分解する樹種の傾向がある．一般に白色腐朽菌は広葉樹を主に分解し，針葉樹を分解するのは褐色腐朽菌である場合が多く，これらは樹種選択性と呼ばれている．しかし，これまで白色腐朽菌と褐色腐朽菌を用いて調べられていたが，この2つのグループは分解メカニズムが大きく違うため，樹種選択性を支える仕組みは長らく不明であった．そこで筆者らは，ハラタケ目の中で高い針葉樹分解能力を保持する白色腐朽菌Phlebiopsis giganteaに着目し，通常の白色腐朽菌と分解メカニズムを比較オミクス解析することで樹種選択性の違いに取り組むこととした⁽⁷⁾7) C. Hori, T. Ishida, K. Igarashi, M. Samejima, H. Suzuki, E. Master, P. Ferreira, F. J. Ruiz-Dueñas, B. Held, P. Canessa et al.: PLoS Genet., 10, e1004759 (2014).．特に針葉樹には，抽出成分と呼ばれる抗菌成分が多く含まれているため，針葉樹分解において抽出成分の分解能力が大きく関わっていると予想した．その結果，本菌は，植物細胞壁分解に関わるCAZy遺伝子については通常の白色腐朽菌とほとんど違いがない一方で，抽出成分の分解能力が高いことが示唆された．なかでも，針葉樹の抽出成分として多く含まれる脂質を素早く分解するために，本菌は菌体外リパーゼおよび菌体内グリオキシル酸回路を増強しており，このことが針葉樹を分解できることに関与していることが示唆された．また，筆者らは本リパーゼのリコンビナント酵素を調整し樹木抽出成分と作用させたところ，様々な脂肪酸が検出できたことから，本リパーゼが樹木中に含まれる多様な脂質を分解できることを生化学的に示した（図1図1■担子菌由来リパーゼLip19208のリコンビナント酵素の抽出成分を反応させた際の生成物をGC-MS解析した結果）⁽⁸⁾8) M. Iwata, A. Gutiérrez, G. Marques, G. Sabat, P. J. Kersten, D. Cullen, J. M. Bhatnagar, J. Yadav, A. Lipzen, Y. Yoshinaga et al.: Sci. Rep., 11, 12528 (2020).．以上の通り，木材腐朽菌の多様性について酵素分子メカニズムが明らかになってきているが，機能未知酵素による木材分解への関与や，酵素以外の有機酸などによる関与など他にも考慮すべき点があるため，様々な木材腐朽菌の分解機構が今後も明らかになると考える．

図1■担子菌由来リパーゼLip19208のリコンビナント酵素の抽出成分を反応させた際の生成物をGC-MS解析した結果

3. メタ環境における植物分解のオミクス解析

難分解性の木質の分解は森林生態系における炭素循環の中心的な要素であり，その循環において腐朽菌は重要であると予想されてきた．これまで植物分解に関わる酵素に関しては，単離した菌を対象とした実験室内条件での報告がなされ，試験管内で多くの腐朽菌由来のセルラーゼ・ヘミセルラーゼが研究されてきた．しかし，自然環境下では様々な微生物が腐朽に関わると予想されるが，このようなメタ環境下における樹木分解プロセスの詳細は不明であった．そこで筆者らは環境条件下での微生物による植物細胞壁分解において実際に働いている酵素を，これまで試験官内で適用してきたマルチ・オミクス解析を環境条件に応用することで初めて網羅的に同定した⁽⁹⁾9) C. Hori, J. Gaskell, D. Cullen, G. Sabat, P. E. Stewart, K. Lail, Y. Peng, K. Barry, I. V. Grigoriev, A. Kohler et al.: Appl. Environ. Microbiol., 84, e01133 (2018).．実際には，環境下で腐朽されたコントルタマツを回収し，ゲノム，mRNA，タンパク質を抽出し，それぞれ次世代シーケンサーやLC-MS/MSで網羅的に解析することで，メタゲノム解析・メタトランスクリプトーム解析，メタプロテオーム解析を同時に行った．特に，メタトランスクリプトームはde-novoアセンブリーを行い，得られた52,011個のコンティグに対して機能解析を行った．その結果，1,316コンティグがCAZyをコードした転写産物であり（図2図2■環境中の腐朽木メタトランスクリプトーム解析によって取得された52,011コンティグの推定機能解析結果），それら遺伝子の多くは白色腐朽菌および褐色腐朽菌が含まれる担子菌由来であった（図3図3■環境中の腐朽木メタトランスクリプトーム解析によって取得されたCAZyをコードする1,316コンティグを相同性検索によって帰属した際のトップ30種の分布結果）．メタゲノム解析の結果，同定された種の中で優勢であったのは子嚢菌であった（即ち，担子菌は優勢でなかった）一方で，担子菌が植物分解に関わる転写産物を多く生産していたことは大変興味深い結果であった．本研究から，環境中の木質分解において木材腐朽菌が重要な働きをしていること，即ち森林生態系における炭素循環において重要であることを初めて明らかにした．さらに，転写産物を詳細に機能解析した結果，これまで試験官内実験で解析されてきた主要なセルラーゼやヘミセルラーゼが環境条件下でも高発現していた．例えば，白色腐朽菌が生産するセルラーゼとして知られている糖質加水分解酵素（GH）ファミリー6, 7, 5, 12, 45や，セルロースを酸化的に分解すると考えられている補助活性（Auxilary Activities; AA）ファミリー9の多糖溶解モノオキシゲナーゼが，実際の植物分解を担っていることを証明した．さらに，白色腐朽菌が生産するマンガンペルオキシダーゼと同時に，褐色腐朽菌が生産するキノン還元酵素をが同定されたことは，環境中において白色腐朽菌や褐色腐朽菌が共存して木質を分解していることを強く示す．さらに，本研究から取得した様々な生物由来のメタトランスクリプトーム情報52,011のコンティグには，データベースに登録されているが機能が報告されていない配列（機能未知タンパク質）が17％，データベースに登録されていない全く新しい遺伝子（帰属不可タンパク質）が23％も含まれていた（図2図2■環境中の腐朽木メタトランスクリプトーム解析によって取得された52,011コンティグの推定機能解析結果）．今後は環境中の効率的な植物分解機構の理解に加えて，これら機能未知遺伝子の酵素機能の解明および植物バイオマス分解応用が期待される．

図2■環境中の腐朽木メタトランスクリプトーム解析によって取得された52,011コンティグの推定機能解析結果

図3■環境中の腐朽木メタトランスクリプトーム解析によって取得されたCAZyをコードする1,316コンティグを相同性検索によって帰属した際のトップ30種の分布結果