1. 新たな遺伝子導入法

パーティクルガン法による遺伝子導入には，専用の装置が必要であるが，特別な機器を必要としない新たな遺伝子導入法が開発されている．その1つは，“ペプチド”を用いた方法である．ペプチド法は，葉緑体移行シグナル配列とポリカチオン性ペプチドを融合した機能性ペプチドをプラスミドDNA（葉緑体形質転換ベクター）と混合することでイオン性の複合体を形成し，植物細胞に注入する方法である（図1図1■高等植物の葉緑体形質転換）．当該法を用いて，シロイヌナズナ，タバコ，イネ，ケナフの葉緑体ゲノムへの遺伝子導入が報告されている^{(7, 8)}7) T. Yoshizumi, K. Oikawa, J. A. Chuah, Y. Kodama & K. Numata: Biomacromolecules, 19, 1582 (2018).8) M. Odahara, Y. Horii, J. Itami, K. Watanabe & K. Numata: Front. Plant Sci., 13, 989310 (2022).．もっとも，いずれの植物（タバコを含む）においても，野生型と組換え型の葉緑体DNAとが混在する“ヘテロプラズミック”な形質転換体の取得にしか至っていない^{(7, 8)}7) T. Yoshizumi, K. Oikawa, J. A. Chuah, Y. Kodama & K. Numata: Biomacromolecules, 19, 1582 (2018).8) M. Odahara, Y. Horii, J. Itami, K. Watanabe & K. Numata: Front. Plant Sci., 13, 989310 (2022).．今後，遺伝子導入効率の向上や，組織培養・選抜条件の至適化などを通して，ホモプラズミックな組換え体が取得されることを期待したい．他にも，“カーボンナノチューブ”を用いてプラスミドDNAを葉緑体に送達し，レポーター遺伝子の一過性発現に成功した例が報告されている（図1図1■高等植物の葉緑体形質転換）⁽⁹⁾9) S.-Y. Kwak, T. T. S. Lew, C. J. Sweeney, V. B. Koman, M. H. Wong, K. Bohmert-Tatarev, K. D. Snell, J. S. Seo, N.-H. Chua & M. S. Strano: Nat. Nanotechnol., 14, 447 (2019).．

以上の新たな遺伝子導入法により，雌性配偶体や（茎頂）分裂組織に存在するコピー数が少ない色素体DNAへの効率的な遺伝子導入が可能となれば，選抜培地上で種子を発芽させることによって組換え体を取得する“組織培養の要らない”葉緑体形質転換法の創出につながることも期待される．

2. 相同組換えを必要としない外来遺伝子導入法

相同組換えを介して葉緑体DNA上に外来遺伝子を導入する従来型の葉緑体形質転換ではなく，ゲノムDNAから独立して複製可能なベクターが，最近，開発された．その1つは，植物に感染するジェミニウイルス（beet curly top geminivirus（BCTV））の複製メカニズムをもとに構築された「ミニクロモソーム（minichromosome）⁽¹⁰⁾10) A. Jakubiec, A. Sarokina, S. Choinard, F. Vlad, I. Malcuit & A. P. Sorokin: Nat. Plants, 7, 932 (2021).」である．このシステムは，ウイルス由来の複製開始因子（Rep）とRepが認識するウイルス複製起点（VOR）から構成される（図2A図2■相同組換えを必要としない外来遺伝子導入法）．核ゲノムに葉緑体局在型のRepを導入するか，または，葉緑体ゲノム上にRepが挿入された形質転換体に対して，目的遺伝子の両端にVORをもつDNAが導入されると，葉緑体内のDNA複製系によって環状のミニクロモソームが増幅される（図2A図2■相同組換えを必要としない外来遺伝子導入法）．

図2■相同組換えを必要としない外来遺伝子導入法

（A） ミニクロモソーム（minichromosome）の模式図．ジェミニウイルス（beet curly top geminivirus（BCTV））由来の複製開始因子（Rep），Repが認識するウイルス複製起点（VOR），葉緑体移行シグナル配列（TP），目的遺伝子（GOI）．図中の1は核ゲノムコードの葉緑体局在型Repが，2は葉緑体ゲノムコードのRepが作用する場合を示す．　
（B） ミニシンプラストーム（mini-synplastome）の模式図．Oriは，タバコ葉緑体DNA由来の複製起点（ori A2, ori A1）とNicotiana plastid extrachromosomal element（NICE1）をまとめた配列を示す．

また，タバコ葉緑体DNA由来の複製起点（ori A2, ori A1）と，ゲノムDNAとは異なる小型の環状二本鎖DNAの形成に関わるNicotiana plastid extrachromosomal element（NICE1）⁽¹¹⁾11) J. M. Staub & P. Maliga: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7468 (1994).を有するベクターを出発材料として，ジャガイモ葉緑体を対象に設計・構築・評価・学習（DBTL）サイクルを繰り返すことで，ゲノムDNAからは独立して複製される「ミニシンプラストーム（mini-synplastome）⁽¹²⁾12) A. Occhialini, A. C. Pfotenhauer, L. Li, S. A. Harbison, A. J. Lail, J. N. Burris, C. Piasecki, A. A. Piatek, H. Daniell, C. N. Stewart Jr. et al.: Plant Biotechnol. J., 20, 360 (2022).」が開発されている（図2B図2■相同組換えを必要としない外来遺伝子導入法）．ミニクロモソームとミニシンプラストームはともに，1）世代を経ても一定のコピー数が維持される，2）相同組換えを介して作出された葉緑体形質転換体と同等のタンパク質高発現が可能などの有用性を備えている^{(10, 12)}10) A. Jakubiec, A. Sarokina, S. Choinard, F. Vlad, I. Malcuit & A. P. Sorokin: Nat. Plants, 7, 932 (2021).12) A. Occhialini, A. C. Pfotenhauer, L. Li, S. A. Harbison, A. J. Lail, J. N. Burris, C. Piasecki, A. A. Piatek, H. Daniell, C. N. Stewart Jr. et al.: Plant Biotechnol. J., 20, 360 (2022).．関連技術がさらに発展することで，従来型の葉緑体形質転換が困難な植物への葉緑体工学の適用拡大が期待される．

3. 葉緑体ゲノム編集

前術のように，葉緑体ゲノムにコードされた遺伝子の数は決して多くはないが，その中には，重要な光合成タンパク質も存在する．一例としては，炭酸固定で中心的な役割を果たすRubisco大サブユニット遺伝子（rbcL）や，光化学系II反応中心D1タンパク質遺伝子（psbA）などが挙げられる．それらの遺伝子を改変することで，光合成機能の強化や除草剤耐性の付与など，農業上有用な形質をもつ作物の創出につながることが期待される．葉緑体遺伝子の塩基配列を効率的に改変する新技術として，病原菌（Xanthomonas属）由来のTranscription Activator-Like Effector（TALE）を用いた「標的一塩基置換技術」が注目されている．TALEにシチジンデアミナーゼ（CD）を融合した葉緑体局在型TALECD遺伝子を核ゲノムに導入することで，葉緑体DNA上の標的シトシンの全てをチミンに変換したホモプラズミックな変異型葉緑体DNAをもつシロイヌナズナが作出されている（図3図3■葉緑体ゲノム標的一塩基置換技術）^{(13, 14)}13) I. Nakazato, M. Okuno, H. Yamamoto, Y. Tamura, T. Itoh, T. Shikanai, H. Takanashi, N. Tsutsumi & S.-I. Arimura: Nat. Plants, 7, 906 (2021).14) I. Nakazato, M. Okuno, T. Itoh, N. Tsutsumi & S.-I. Arimura: Plant J., 115, 1151 (2023).．同様の方法は，レタス，ナタネ，イネなどの実用植物にも適用可能である^{(15, 16)}15) B.-C. Kang, S. J. Bae, S. Lee, J. S. Lee, A. Kim, H. Lee, G. Baek, H. Seo, J. Kim & J.-S. Kim: Nat. Plants, 7, 899 (2021).16) R. Li, S. N. Char, B. Liu, H. Liu, X. Li & B. Yang: Mol. Plant, 14, 1412 (2021).．したがって，従来型の葉緑体形質転換が困難な植物種に対しても，光合成関連遺伝子の改変を可能にする有用なゲノム編集ツールが確立されたといえる．

図3■葉緑体ゲノム標的一塩基置換技術

Transcription Activator-Like Effector（TALE），シチジンデアミナーゼ（CD），葉緑体移行シグナル配列（TP）．

1. ヒト用の「食べるワクチン・治療薬」

医薬品製造は，「Good Manufacturing Practice（GMP）」に準じて行うことが定められている．植物を用いた医薬品生産でGMPを満たすには，人工照明の下で植物を栽培する閉鎖型植物工場の活用が想定される．閉鎖型植物工場で生産管理しやすい作物としては，葉物野菜が挙げられる．“レタス”は，葉緑体形質転換が可能な数少ない植物種の1つであり，かつ，上記の要件を満たすことから，葉緑体工学を基盤とした医薬品生産に適した宿主植物といえる．葉緑体形質転換レタスを用いた「食べるワクチン・治療薬」の開発は，ペンシルベニア大学のDaniellらの研究グループを中心に進められている⁽¹⁹⁾19) I. Khan & H. Daniell: Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 54, 101452 (2021).．そのシステムの概要は以下の通りである．目的タンパク質（抗原・治療薬）を発現する葉緑体形質転換レタスは，凍結乾燥後，微粉砕して経口投与される（用途によっては，粉末のカプセル化も想定）．細胞壁に囲まれた植物細胞は，胃酸やプロテアーゼから目的（医療用）タンパク質を保護する“バイオカプセル”としてはたらき，小腸まで到達する（図4図4■葉緑体形質転換レタスを用いた「経口ワクチン・治療薬」）．小腸では，常在細菌が生産する細胞壁分解酵素（セルラーゼなど）のはたらきで細胞壁が分解され，目的タンパク質が放出される．Daniellらのシステムでは，目的タンパク質は“コレラ毒素Bサブユニット（CTB）”との融合タンパク質として発現される（図4図4■葉緑体形質転換レタスを用いた「経口ワクチン・治療薬」）．CTBに毒性はないが，CTB 5量体は腸上皮細胞に存在する受容体（GM1）に認識され，エンドサイトーシスによって目的タンパク質と共に腸上皮細胞に取り込まれる（図4図4■葉緑体形質転換レタスを用いた「経口ワクチン・治療薬」）．腸上皮細胞内では，プロテアーゼ（フーリン）のはたらきで，CTBと目的タンパク質との間の切断部位が認識され，目的タンパク質が遊離する．その後，目的タンパク質は細胞外へと移行するが，抗原であれば免疫細胞に，治療薬であれば循環器系を通して体中に運搬され，効果を発揮する（図4図4■葉緑体形質転換レタスを用いた「経口ワクチン・治療薬」）．当該システムを用いた経口ワクチンとしては，結核やポリオなどを予防するブースター・ワクチンが開発されている^{(20, 21)}20) P. S. Lakshmi, D. Verma, X. Yang, B. Lloyd & H. Daniell: PLoS One, 8, e54708 (2013).21) H. Daniell, V. Rai & Y. Xiao: Plant Biotechnol. J., 17, 1357 (2019).．また，糖尿病の治療薬としてのプロインスリン⁽²²⁾22) H. Daniell, R. Singh, V. Mangu, S. K. Nair, G. Wakade & N. Balashova: Biomaterials, 298, 122142 (2023).，肺高血圧症の治療薬であるアンジオテンシン1-7（血管拡張・血圧低下を誘導するペプチド）とアンジオテンシン変換酵素2（ACE 2：アンジオテンシン1-7を生成するペプチダーゼ）⁽²³⁾23) H. Daniell, V. Mangu, B. Yakubov, J. Park, P. Habibi, Y. Shi, P. A. Gonnella, A. Fisher, T. Cook, L. Zeng et al.: Biomaterials, 233, 119750 (2020).が，CTBとの融合タンパク質としてレタス葉緑体で大量発現され，組換えレタスの乾燥粉末をマウスに経口投与することで，有効性が確認されている^{(22, 23)}22) H. Daniell, R. Singh, V. Mangu, S. K. Nair, G. Wakade & N. Balashova: Biomaterials, 298, 122142 (2023).23) H. Daniell, V. Mangu, B. Yakubov, J. Park, P. Habibi, Y. Shi, P. A. Gonnella, A. Fisher, T. Cook, L. Zeng et al.: Biomaterials, 233, 119750 (2020).．さらに，ACE2は新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）がヒト細胞に感染する際の受容体として機能することから，CTB-ACE2がSARS-CoV-2の細胞侵入を阻害することが実証されている⁽²⁴⁾24) H. Daniell, S. K. Nair, N. Esmaeili, G. Wakade, N. Shahid, P. K. Ganesan, M. R. Islam, A. Shepley-McTaggart, S. Feng, E. N. Gary et al.: Mol. Ther., 30, 1966 (2022).．現在，CTB-ACE2を発現する葉緑体形質転換レタスの乾燥粉末を配合した“チューインガム”を口腔内でウイルスを除去する感染予防薬とすることが検討されており，第I/II相臨床試験が進められている⁽²⁵⁾25) H. Daniell, S. K. Nair, H. Guan, Y. Guo, R. J. Kulchar, M. D. T. Torres, M. Shahed-Al-Mahmud, G. Wakade, Y.-M. Liu, A. D. Marques et al.: Biomaterials, 288, 121671 (2022).．

図4■葉緑体形質転換レタスを用いた「経口ワクチン・治療薬」

2. 水産用経口ワクチン植物

養殖業の持続的な発展に不可欠な要素の1つとして，魚病防除がある．水産用医薬品の主流は，抗菌・抗生物質からワクチンへと移りつつあるが，現行の水産用ワクチンは，専ら，魚1尾ずつに対して接種する“注射型”である．そのため，1）接種にかかる労力や時間，2）仔稚魚には接種できない，3）ワクチンが高価 などの課題がある．筆者らは，病原体由来の抗原タンパク質を大量発現する葉緑体形質転換植物を作出し，当該植物由来の乾燥粉末（またはタンパク質粗抽出液）を餌に混ぜて経口投与することで免疫を賦活化する「水産用経口ワクチン植物」の開発を進めている（図5図5■葉緑体工学でつくる「水産用経口ワクチン植物」）．一例として，海産養殖魚（マハタ・クエなど）が罹患する“ウイルス性神経壊死症”を対象に，原因ウイルス（RGNNV）由来の外殻タンパク質（RGNNV-CP）を発現する葉緑体形質転換タバコを作出した．その結果，RGNNV-CPの発現量は緑葉で最も豊富に存在するRubisco大サブユニット（RbcL）よりも多く，3 g/kg（新鮮葉）に達した⁽²⁶⁾26) Y. Nakahira, K. Mizuno, H. Yamashita, M. Tsuchikura, K. Takeuchi, T. Shiina & H. Kawakami: Front Plant Sci., 12, 717952 (2021).．当該組換えタバコの葉を透過型電子顕微鏡で観察したところ，RGNNV-CPが葉緑体内で自己組織化して“ウイルス様粒子（VLP）”を形成していることが分かった（図5図5■葉緑体工学でつくる「水産用経口ワクチン植物」）⁽²⁶⁾26) Y. Nakahira, K. Mizuno, H. Yamashita, M. Tsuchikura, K. Takeuchi, T. Shiina & H. Kawakami: Front Plant Sci., 12, 717952 (2021).．VLPはウイルスと同等の形をしながらも，遺伝情報を含まず感染性がないため，医療では安全かつ免疫原性の高いワクチンとして活用されている．そこで，前述の葉緑体形質転換タバコの葉からニコチン等の低分子化合物を除去したタンパク質粗抽出液を調製し，マハタに注射・経口投与したところ，市販の注射型ワクチンと比較して同等以上の高い免疫原性を示した⁽²⁶⁾26) Y. Nakahira, K. Mizuno, H. Yamashita, M. Tsuchikura, K. Takeuchi, T. Shiina & H. Kawakami: Front Plant Sci., 12, 717952 (2021).．以上のタバコを宿主とした実験は概念実証を目的に実施したものであるが，現在，レタスを宿主した葉緑体形質転換体を作出し，当該組換えレタス由来の乾燥粉末を餌に混ぜて魚に経口投与することで，有効なワクチンとなるか，検証中である．

図5■葉緑体工学でつくる「水産用経口ワクチン植物」