1. 外来性酸化ストレスに対するKeap1タンパク質修飾依存性のNrf2活性化

Keap1はNrf2の活性を抑制するNrf2のN末端のNeh2ドメインに結合する因子として酵母ツーハイブリッド法により見出された（図1B図1■CNC転写因子群とNrf2とKeap1のドメイン構造）⁽²⁾2) K. Itoh, J. Mimura & M. Yamamoto: Antioxid. Redox Signal., 13, 1665 (2010).．Neh2ドメインにはKeap1に結合するための高親和性ETGEモチーフと低親和性DLGモチーフがありこの2つのモチーフがKeap1二量体に結合し，モチーフの間にある複数のリジンがユビキチン化される（図3図3■Nrf2の分解機構と活性化機構）．親電子性物質はKeap1のシステインチオール基に共有結合することによりKeap1のコンフォメーション変化をおこしNrf2のユビキチン化を抑制するが，DLGモチーフとKeap1との結合が乖離してユビキチン化が起きなくなるモデルを「蝶番と閂」モデルと呼んでいる．Nrf2を活性化する親電子性物質の代表的なものを図4図4■Nrf2を活性化する親電子性物質に示す．ETGEモチーフが蝶番の役割を，DLGモチーフが閂の役割を果たす．Keap1とETGEモチーフとの結合は，親電子性物質により乖離せず，新規合成されたNrf2はKeap1による抑制を逃れて核に移行する．コハク酸のようにKeap1のリジンをセンサーとする場合もある⁽⁴⁾4) L. Ibrahim, C. Stanton, K. Nutsch, T. Nguyen, C. Li-Ma, Y. Ko, G. C. Lander, R. L. Wiseman & M. J. Bollong: Cell Chem. Biol., 30, 1295 (2023).．上記の場合以外にもKeap1とCul3との乖離やKeap1の分解などのようにKeap1による分解系を阻害するに至る種々の経路がNrf2を活性化することは重要である．例えばFGF18は脱ユビキチン化酵素USP16の発現を抑制し，Keap1のユビキチン化促進による分解を誘導してNrf2を活性化する⁽⁵⁾5) G. Tong, Y. Chen, X. Chen, J. Fan, K. Zhu, Z. Hu, S. Li, J. Zhu, J. Feng, Z. Wu et al.: Nat. Commun., 14, 6107 (2023).．また，シャペロン媒介性オートファジーはKeap1を分解してNrf2を活性化する⁽⁶⁾6) L. Zhu, S. He, L. Huang, D. Ren, T. Nie, K. Tao, L. Xia, F. Lu, Z. Mao & Q. Yang: Aging Cell, 21, e13616 (2022).．一方，種々のシグナルはNrf2を抑制することが知られている．例えば，過酸化水素はKeap1経路を介しNrf2タンパク質を安定化する一方で，Nrf2のタンパク質合成を抑制するために強い誘導剤にはならない．また，皮膚創傷治癒などにおいて，活性酸素は脂質過酸化を介してCavin-1を遊離し，Nrf2に結合してそのタンパク質分解を促進する⁽⁷⁾7) Y. Wu, Y. W. Lim, D. A. Stroud, N. Martel, T. E. Hall, H. P. Lo, C. Ferguson, M. T. Ryan, K. A. McMahon & R. G. Parton: Dev. Cell, 58, 376 (2023).．種々の病態でKeap1が増加する場合には，Nrf2経路は抑制される．

図4■Nrf2を活性化する親電子性物質

2. Keap1の酸化修飾非依存性のNrf2の活性化

Nrf2はGSK3βによりリン酸化されSCF（Skp1-Cullin1-F-box protein）^β-TrCPを介した系によりプロテアソームで分解される．IGF-1などの増殖因子は，PI3K-AKT経路を介してGSK3βをリン酸化しこの分解経路を抑制する．Keap1非依存性のNrf2を活性化するシグナル（多くは酸化ストレス非依存性）としてはオートファジー因子であるp62が重要であり，Keap1のcanonical経路に対してnon-canonical経路として知られている．p62はSTGEモチーフを有しており，オートファジー誘導下でmTORC1によってこのモチーフ中のセリンがリン酸化されると，マイナス荷電の付与によりKeap1との結合が増加しKeap1とNrf2 DLGモチーフ（閂部分）の結合に競合し，Nrf2を活性化する．STGEモチーフのリン酸化は小腸上皮のTAK1を介したNrf2の基礎的発現⁽⁸⁾8) K. Hashimoto, A. N. Simmons, R. Kajino-Sakamoto, Y. Tsuji & J. Ninomiya-Tsuji: Antioxid. Redox Signal., 25, 953 (2016).や遅筋における運動によるNrf2の活性化⁽⁹⁾9) M. Yamada, M. Iwata, E. Warabi, H. Oishi, V. A. Lira & M. Okutsu: FASEB J., 33, 8022 (2019).に関与することが報告されている．さらに，p62はオートファジーを介してKeap1を分解してNrf2を活性化する⁽¹⁰⁾10) D. H. Lee, J. S. Park, Y. S. Lee, J. Han, D. K. Lee, S. W. Kwon, D. H. Han, Y. H. Lee & S. H. Bae: Autophagy, 16, 1949 (2020).．

3. Nrf2の基礎レベルでの活性化

Nrf2の基礎レベル（外来性ストレスがない場合）での活性化状態は，主にmRNAの発現レベルやIGF-1などの増殖因子シグナル，血流ずり応力などによって決定される．いずれも，親電子性物質などの急性暴露による活性化ほど強い活性化には至らないが，これらの変動が生体のレドックス制御に大きな役割を果たすと考えられる．主に肝臓で産生されるIGF-1は循環血流にのり，PI3K-AKT経路を介して血管のNrf2レベルを調節する⁽¹¹⁾11) L. C. Bailey-Downs, M. Mitschelen, D. Sosnowska, P. Toth, J. T. Pinto, P. Ballabh, M. N. Valcarcel-Ares, J. Farley, A. Koller, J. C. Henthorn et al.: J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 67, 313 (2012).．ヒトにおいて，Nrf2遺伝子発現を制御する機能的なSNPが知られており，マイナーアレル保持者では，動脈硬化や騒音性難聴などの種々の疾患に感受性であることが知られている^{(12, 13}12) S. Shimizu, J. Mimura, T. Hasegawa, E. Shimizu, S. Imoto, M. Tsushima, S. Kasai, H. Yamazaki, Y. Ushida, H. Suganuma et al.: PLoS One, 15, e0236834 (2020).⁾．また，Nrf2遺伝子発現はMEF2やNrf2自身によるpositive feedbackにより正に制御される⁽¹⁴⁾14) M. Tsushima, J. Liu, W. Hirao, H. Yamazaki, H. Tomita & K. Itoh: Arch. Pharm. Res., 43, 286 (2020).．

4. 親電子性物質シグナルによるNrf2の活性制御

生体で血流ずり応力や急性炎症などに応答して生合成される親電子性のシクロペンテノン群のプロスタグランジン（15d-PGJ₂など）がKeap1システインチオール基の酸化修飾によりNrf2を活性化していることを我々は以前に見出した⁽²⁾2) K. Itoh, J. Mimura & M. Yamamoto: Antioxid. Redox Signal., 13, 1665 (2010).．また，炎症の過程で産生されるニトロ化脂肪酸や8-nitro-cGMP（8-ニトロサイクリックGMP）⁽¹⁵⁾15) F. J. Schopfer & N. K. H. Khoo: Trends Endocrinol. Metab., 30, 505 (2019).，LPS刺激によりTCAサイクルの中間代謝産物より産生されるitaconateもNrf2経路を活性化する⁽¹⁶⁾16) J. Blay-Cadanet, A. Pedersen & C. K. Holm: Front. Immunol., 12, 635738 (2021).．

また，グリセルアルデヒド-3-リン酸やメチルグリオキサールなどの解糖系の反応性代謝産物^{(4, 17)}4) L. Ibrahim, C. Stanton, K. Nutsch, T. Nguyen, C. Li-Ma, Y. Ko, G. C. Lander, R. L. Wiseman & M. J. Bollong: Cell Chem. Biol., 30, 1295 (2023).17) M. J. Bollong, G. Lee, J. S. Coukos, H. Yun, C. Zambaldo, J. W. Chang, E. N. Chin, I. Ahmad, A. K. Chatterjee, L. L. Lairson et al.: Nature, 562, 600 (2018).，TCAサイクルの代謝中間産物であるコハク酸は高濃度で蓄積した時にNrf2を活性化する．トリプトファンの代謝産物であるキヌレニン，3-ヒドロキシキヌレニン，3-ヒドロキシアントラニル酸もNrf2を活性化することが最近報告された⁽¹⁸⁾18) A. Fiore, L. Zeitler, M. Russier, A. Gross, M. K. Hiller, J. L. Parker, L. Stier, T. Kocher, S. Newstead & P. J. Murray: Mol. Cell, 82, 920 (2022).．

1. 老化制御におけるNrf2の役割

Harman博士の“ミトコンドリアフリーラジカル説”によると，ミトコンドリア電子伝達鎖由来の活性酸素は核・ミトコンドリアゲノムのDNA障害を誘起して老化を促進する⁽²³⁾23) D. Harman: J. Gerontol., 11, 298 (1956).．また，紫外線や喫煙などの環境因子も同様にフリーラジカルを介してゲノム障害を引き起こす．さらに，老化に伴って生じる慢性炎症はinflammagingとも言われ，酸化ストレスを伴い老化を促進する．Nrf2は抗酸化・抗炎症経路を制御し，さらにプロテオスターシスを促進することで，老化を調節することが考えられる．老化によってNrf2経路が減弱するという複数の報告がある⁽²⁴⁾24) G. A. Shilovsky: Biochemistry (Mosc.), 87, 70 (2022).．C57BL/6雄マウスではNrf2欠失により最大寿命が短縮する⁽²⁵⁾25) L. C. D. Pomatto, T. Dill, B. Carboneau, S. Levan, J. Kato, E. M. Mercken, K. J. Pearson, M. Bernier & R. de Cabo: Free Radic. Biol. Med., 152, 650 (2020).．しかしながら，カロリー制限による寿命延長効果にはNrf2は必要ではない^{(25, 26)}25) L. C. D. Pomatto, T. Dill, B. Carboneau, S. Levan, J. Kato, E. M. Mercken, K. J. Pearson, M. Bernier & R. de Cabo: Free Radic. Biol. Med., 152, 650 (2020).26) K. J. Pearson, K. N. Lewis, N. L. Price, J. W. Chang, E. Perez, M. V. Cascajo, K. L. Tamashiro, S. Poosala, A. Csiszar, Z. Ungvari et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 2325 (2008).．Nrf2シグナル経路の活性化はハダカデバネズミなどの長寿命のネズミにおいて見出されており，10種の齧歯類の比較では，Nrf2のARE結合活性は寿命と正に相関し，Keap1とSCF^bTRCPのタンパク質量は寿命と負に相関する⁽²⁷⁾27) K. N. Lewis, E. Wason, Y. H. Edrey, D. M. Kristan, E. Nevo & R. Buffenstein: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 3722 (2015).．ヒトにおいても，早老症の1つであるハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群患者では核ラミンタンパク質の変異によりNrf2が不活性化されている⁽²⁸⁾28) N. Kubben, W. Zhang, L. Wang, T. C. Voss, J. Yang, J. Qu, G. H. Liu & T. Misteli: Cell, 165, 1361 (2016).．また，SKN-1は線虫の寿命制御に重要な因子である⁽²⁹⁾29) C. K. Ewe, G. Alok & J. H. Rothman: Dev. Biol., 471, 34 (2021).．以上のことからNrf2は多様な動物種で最大寿命あるいは平均寿命の制御に関与しているものと考えられる．

2. Nrf2を中心にしたミトコンドリアの老化制御応答のネットワーク

Nrf2はPGC1α, Nrf-1（Nuclear respiratory factor 1）やTFAMの遺伝子発現を制御して運動による骨格筋や心臓の抗酸化作用やミトコンドリアバイオジェネシス（ミトコンドリアの生合成）を活性化する⁽³⁰⁾30) S. Kasai, S. Shimizu, Y. Tatara, J. Mimura & K. Itoh: Biomolecules, 10, 320 (2020).．また，Nrf2は種々のメカニズムでミトコンドリアの活性調節およびミトコンドリア恒常性維持機構に関与しており，Nrf2の活性低下はミトコンドリア機能を低下させる⁽³⁰⁾30) S. Kasai, S. Shimizu, Y. Tatara, J. Mimura & K. Itoh: Biomolecules, 10, 320 (2020).．Nrf2 KOマウスの肝臓ではSirt1とSirt3の発現低下が観察される一方で，ChIP-Seqデータベースの解析から，Nrf2はSirt3とSirt7のプロモーター配列に結合することが示唆されている⁽³¹⁾31) A. Kim, J. H. Koo, J. M. Lee, M. S. Joo, T. H. Kim, H. Kim, D. W. Jun & S. G. Kim: FASEB J., 36, e22170 (2022).．SIRT6は遺伝子欠失により早期老化を来たすことから注目される核内サーチュインで，Nrf2と相互作用して転写を活性化する．また，SIRT6はKeap1の遺伝子発現を抑制する⁽³²⁾32) A. Kanwal, V. B. Pillai, S. Samant, M. Gupta & M. P. Gupta: FASEB J., 33, 10872 (2019).．PGC1αは骨格筋においてミトコンドリアバイオジェネシスの制御因子で，ミトコンドリアの活性と相関していることが多い．PGC1αはNrf2の上流，下流，およびコアクチベーターとしても働く⁽³³⁾33) A. P. Gureev, E. A. Shaforostova & V. N. Popov: Front. Genet., 10, 435 (2019).．一方で，Nrf2が制御する抗酸化タンパク質のほとんどは細胞質に局在する（図2図2■Nrf2が制御する遺伝子の抗酸化的な働き）．加齢ではミトコンドリア電子伝達系の活性が低下するが，Balsa E.らはcomplex Iの低下によりNADHの酸化が低下するとMTHFD2やALDH1L2を介したone carbon metabolismによるミトコンドリアでのNADPHの産生が低下し細胞質に酸化型グルタチオン／還元型グルタチオンの比が増加することを示した（図5図5■Nrf2を中心とした転写因子のネットワークとミトコンドリア酸化ストレス防御機構）⁽³⁴⁾34) E. Balsa, E. A. Perry, C. F. Bennett, M. Jedrychowski, S. P. Gygi, J. G. Doench & P. Puigserver: Nat. Commun., 11, 2714 (2020).．これは，IDH1とIDH2により作り出させれるミトコンドリア–細胞質間のNADPHシャトルによるものらしい．したがってcomplex Iの低下は結果的に細胞質のNADPH産生を低下させる．Nrf2はペントースリン酸回路やMalic enzymeを介したNADPH産生を制御するので，このようなミトコンドリア由来の酸化ストレスにも防御的に働く．

図5■Nrf2を中心とした転写因子のネットワークとミトコンドリア酸化ストレス防御機構

3. ATF4経路はミトコンドリア異常に対する適応応答を担う

小胞体ストレス，アミノ酸飢餓，ヘム欠乏，ウイルス感染などの種々のストレスはそれぞれPERK, GCN2, HRI, PKRによるeIF2αのリン酸化を介してATF4を翻訳レベルで活性化し一連の遺伝子応答を惹起する⁽³⁵⁾35) K. Ameri & A. L. Harris: Int. J. Biochem. Cell Biol., 40, 14 (2008).．このようにATF4は多岐にわたるストレスにより活性化されるため，eIF2α-ATF4を介した遺伝子応答は統合的ストレス応答（Integrated Stress Response; ISR）と呼ばれる．ATF4はC/EBPγまたはC/EBPβと相互作用してアミノ酸飢餓応答配列（AARE）に結合し，主に細胞膜表面のアミノ酸トランスポーターやアミノ酸合成酵素，CHOPなどの転写因子の遺伝子発現を活性化する⁽³⁵⁾35) K. Ameri & A. L. Harris: Int. J. Biochem. Cell Biol., 40, 14 (2008).．

近年，ATF4は哺乳動物におけるミトコンドリアストレスに応答する代表的な転写因子であることが確立された⁽³⁶⁾36) S. Kasai, H. Yamazaki, K. Tanji, M. J. Engler, T. Matsumiya & K. Itoh: J. Clin. Biochem. Nutr., 64, 1 (2019).．ミトコンドリアストレスによるATF4活性化は主にHRIあるいはGCN2を介することが報告されている．近年，呼吸鎖複合体Vの阻害がミトコンドリアプロテアーゼであるOMA1を活性化し，それによって切断されたDELE1（DELE1s）がHRIを活性化することが明らかにされた^{(37, 38)}37) X. Guo, G. Aviles, Y. Liu, R. Tian, B. A. Unger, Y. T. Lin, A. P. Wiita, K. Xu, M. A. Correia & M. Kampmann: Nature, 579, 427 (2020).38) E. Fessler, E. M. Eckl, S. Schmitt, I. A. Mancilla, M. F. Meyer-Bender, M. Hanf, J. Philippou-Massier, S. Krebs, H. Zischka & L. T. Jae: Nature, 579, 433 (2020).．また，1-nitropyreneは精巣でミトコンドリアROSを介してリボソーム停滞を引き起こしGCN2を活性化，ステロイドホルモンの産生を抑制するという興味深い現象がある⁽³⁹⁾39) J. Li, L. Gao, J. Chen, W. W. Zhang, X. Y. Zhang, B. Wang, C. Zhang, Y. Wang, Y. C. Huang, H. Wang et al.: Environ. Int., 167, 107393 (2022).．