花の色のもととなる色素分子グループ

花の色のもととなる色素分子は概ね3種類のブループに大別される．カロテノイド，フラボノイド，ベタレインである⁽¹⁾1) Y. Tanaka, N. Sasaki & A. Ohmiya: Plant J., 54, 733 (2008).．カロテノイドは多くが脂溶性でプラスチド（色素体）に蓄積しており，分子種によって黄色～橙～赤色を示す．フラボノイドとベタレインは水溶性の分子で液胞に蓄積している．フラボノイドには黄色を呈する化合物や，朱～赤～紫～青を呈するアントシアニンが含まれ，多彩な色調を呈する．アントシアニンの基本骨格は概ね6種類であるが，花色としては，単純な赤や紫，青のみならず，さまざまな中間色や微妙に異なる色合いなど，まさに千差万別の色調を示す．ベタレインは赤色を呈するベタシアニンと黄色を呈するベタキサンチンから構成される色素群であり，ナデシコ目の一部の種で合成される植物色素である．ベタレインをもつ植物はアントシアニンを合成せず，また，アントシアニンを合成する植物はベタレインを合成しないという排他性が知られており，未だに植物学上の謎として議論されている⁽²⁾2) T. Timoneda, T. Feng, H. Sheehan, N. Walker-Hale, B. Pucker, S. Lopez-Nieves, R. Guo & S. Brockington: New Phytol., 224, 71 (2019).．ベタレイン色素は概ね赤や紫と黄色を呈し，比較的その色調の幅は狭いが，蛍光色を示すため，非常に鮮やかな発色をもつ．特にベタキサンチンはフラボノイドと比較しても非常に鮮やかな黄色を呈し，花き園芸において価値が高い．

アントシアニン生合成経路

アントシアニンの生合成経路には多くの酵素が関わっており，古くから研究対象とされ，2000年頃までに基本的な生合成経路が解明された．アントシアニンの生合成は芳香族アミノ酸の一種であるフェニルアラニンから始まり，図1図1■アントシアニン生合成経路に示すように概ね10段階の酵素反応を経て基本骨格が完成する．その後，ブドウ糖（グルコース）のような糖や，植物種によってはさらにマロン酸やカフェー酸などの有機酸によって修飾され液胞に蓄積する．この生合成経路のうち，花色の色調を決定づける因子の一つに，基本骨格のB環への水酸基の導入がある．B環に1～3つの水酸基を有するアントシアニンが存在するが，1つでは朱色～赤，2つでは赤～紫，3つでは紫～青といった色調を示すことが多い．この水酸基の導入に関わる酵素遺伝子は，フラボノイド3′-水酸化酵素（F3′H）とフラボノイド3′,5′-水酸化酵素（F3′5′H）である．これら遺伝子は，B環に水酸基を1つ有するジヒドロケンフェロールを基質とし，F3′HはB環に水酸基を2つ有するジヒドロケルセチンを，F3′5′HはB環に水酸基を3つ有するジヒドロミリセチンを生成する酵素をコードする．特にF3′5′Hは花色の青色化に重要な役割を果たすことが知られており，“青色遺伝子”とも呼ばれ，青いカーネーションや青いバラは他の植物種から単離したこの遺伝子を導入することによって作出されている^{(3, 4)}3) Y. Fukui, Y. Tanaka, T. Kusumi, T. Iwashita & K. Nomoto: Phytochemistry, 63, 15 (2003).4) Y. Katsumoto, M. Fukuchi-Mizutani, Y. Fukui, F. Brugliera, T. A. Holton, M. Karan, N. Nakamura, K. Yonekura-Sakakibara, J. Togami, A. Pigeaire et al.: Plant Cell Physiol., 48, 1589 (2007).

図1■アントシアニン生合成経路

アミノ酸の一種であるフェニルアラニンを出発物質としたアントシアニンの基本骨格であるアントシアニジン合成までを図示した．アントシアニジンから先の修飾は植物種により異なる．化合物をつなぐ矢印の隣にある名称はその反応を触媒する酵素の略称を示している．PAL, フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；C4H, 桂皮酸4-水酸化酵素；4CL, 4-クマル酸CoAリガーゼ；CHS, カルコン合成酵素；CHI, カルコン異性化酵素；F3H, フラバノン3-水酸化酵素；F3′H, フラボノイド3′-水酸化酵素；F3′5′H, フラボノイドF3′,5′-水酸化酵素；DFR, ジヒドロフラボノール還元酵素；ANS, アントシアニジン合成酵素

アントシアニン生合成遺伝子情報を用いたデルフィニウムの新規花色の育種

デルフィニウムは主に北半球の高山に自生するキンポウゲ科の植物であり，400種以上の原種が確認されている⁽⁵⁾5) Y. F. Yan, Y. R. Wang, H. J. Jiang, Z. B. Ding & T. P. Yin: Nat. Prod. Res., DOI: 10.1080/14786419.2022.2152022 (2022).．日本では主にDelphinium grandifrolumとDelphinium elatumの2種が育種に利用されており，どちらも元来の濃い青花からさまざまな花色の品種が作出されている．青以外の花色をもつ園芸品種では，白やピンク花のデルフィニウムが作出されている．その他に，濃い赤色のDelphinium cardinaleとオレンジ色のDelphinium nudicaule，黄色のDelphinium zalilのような原種が存在する．

デルフィニウムの花色は，D. grandiflorumやD. elatumの青花ではデルフィニジンを基本構造とするアントシアニンが蓄積している^{(6, 7)}6) N. Miyagawa, Y. Nishizaki, T. Miyahara, M. Okamoto, Y. Hirose, Y. Ozeki & N. Sasaki: Plant Biotechnol., 31, 83 (2014).7) Y. Nishizaki, N. Sasaki, M. Yasunaga, T. Miyahara, E. Okamoto, M. Okamoto, Y. Hirose & Y. Ozeki: J. Exp. Bot., 65, 2495 (2014).．デルフィニウムの青花ではデルフィニジンを合成するF3′5′Hが機能することで，デルフィニジン骨格が形成されるため青い色となる（図1図1■アントシアニン生合成経路）．D. cardinaleのような赤やオレンジ系原種やピンク系の品種では，F3′5′Hが欠失することで，ペラルゴニジン系の基本骨格のまま反応が進み，そこに複数の糖と有機酸が結合した構造のアントシアニンが合成される^{(8, 9)}8) T. Iwashina: Nat. Prod. Commun., 10, 529 (2015).9) N. Miyagawa, T. Miyahara, M. Okamoto, Y. Hirose, K. Sakaguchi, S. Hatano & Y. Ozeki: Plant Biotechnol., 32, 249 (2015).．実際，デルフィニウムの赤花では比較的一般的なシアニジン由来のアントシアニンを蓄積している報告例がない．このためD. grandiflorumやD. elatum系統を用いた品種育成では，シアニジン合成に必要なF3′H遺伝子を持っていないために，デルフィニジンまたはペラルゴニジンに由来する青やピンク色の花以外は得られず，市場の求める新規花色の作出は困難であると考えられた．

このことから，もしF3′H遺伝子を既存のデルフィニウム品種へ導入することができれば，これまでにない花色のデルフィニウムを開発できることが期待された．しかし，遺伝子組換えなどの分子育種技術を駆使した研究開発は，多額のコストがかかるため，市場規模の小さい園芸種の品種開発への導入は障壁が高い．そこで，筆者らは既存の品種や原種について育種への潜在的な価値を調査した．これまで育種されてきた数多くの品種および原種について，色素分析とともにF3′H遺伝子の発現の有無や潜在的な花色への影響の可能性について検討した．その結果，原種のD. zalilは花にフラボノールの一種であるケルセチン配糖体を多量に蓄積していることが確認された⁽¹⁰⁾10) T. Miyahara, A. Hamada, M. Okamoto, Y. Hirose, K. Sakaguchi, S. Hatano & Y. Ozeki: J. Plant Physiol., 202, 92 (2016).．ケルセチンはアントシアニジンの前駆体と共通のジヒドロフラボノールを経由して合成され，その合成経路にはF3′Hが必須である．そこで，F3′H遺伝子の発現を確認したところ，D. zalilの花で高い発現が認められた．さらにこのF3′H遺伝子を酵母で異種発現させたタンパク質を用いて，酵素活性の確認を行ったところ，ジヒドロフラボノールに対して水酸基付加を行う酵素活性を有することが判明した．この結果から，D. zalilがもつF3′Hはその他のアントシアニン合成系の酵素とともに働くことでシアニジンを合成できる可能性が示された．そこでD. zalilと他の赤花品種を従来育種の方法により交雑することで，これまでデルフィニウムには存在しなかった，シアニジン由来のアントシアニンを合成する植物体の開発を計画した．

シアニジンを合成するデルフィニウムの開発計画では，D. zalilと開花時期が一致し，ペラルゴニジン由来のアントシアニンを多量に蓄積するD. cardinaleを交雑親に選定した⁽¹¹⁾11) K. Sakaguchi, C. Isobe, K. Fujita, Y. Ozeki & T. Miyahara: Hortic. J., 88, 514 (2019).．D. cardinaleはF3′5′H遺伝子は欠損しているが，他のアントシアニン生合成遺伝子は正常に有している．すなわち，D. zalilとの交雑第一世代（F₁世代）では，F3′H遺伝子が補われることで，シアニジン由来のアントシアニンが合成されることが予想された．実際に交配した結果，F₁世代は全てシアニジン由来のアントシアニンを主要に蓄積していることが判明した．しかしながら，得られたF₁個体数が少数であったため，アントシアニンの詳細な構造決定には至っていない．花色は鮮やかな赤色で，これまでのデルフィニウムには存在しない新規の花色であった（図2図2■作出されたシアニジン由来のアントシアニンを蓄積するデルフィニウム交雑個体（株式会社ミヨシ坂口公敏博士提供））．残念なことに，F₁世代は雑種不稔であったため，後代を育成することはできていない．しかし，D. zalilを利用することでこれまでに存在しなかったシアニジン由来のアントシアニンを蓄積する系統を作出できることが実証されたため，D. zalilの遺伝資源としての価値が格段に向上した．今後，D. cardinale以外にも，より有用な交雑相手を探すことで鮮やかな赤色系のデルフィニウムの作出が可能となるであろう．

図2■作出されたシアニジン由来のアントシアニンを蓄積するデルフィニウム交雑個体（株式会社ミヨシ坂口公敏博士提供）

ペラルゴニジン由来のアントシアニンを蓄積するデルフィニウムとは異なる深みのある赤色を示した．

この研究では，D. zalilのF3′H遺伝子の発見から実際にシアニジン合成デルフィニウムを得るまでに3年程度で実現している．このように外見からでは分からない遺伝子情報を用いて交配をデザインすることにより，従来育種方法であっても高速に新規品種の開発をする余地が十分にある．この研究成果は，既存の品種の遺伝子情報と色素情報を解析・整理することで，これまでは育種に不向きである（と思いこんでいた），遺伝資源を活用することが可能となることを示した重要な事例であろう．

ベタレイン生合成経路

ベタレイン色素の生合成については長らく不明のままであったが，2000年代以降に重要な発見が続き，生合成経路が明らかとされた．ベタレインは芳香族アミノ酸であるチロシンから生合成が開始される（図3図3■ベタレイン生合成経路）．チロシンはチロシン水酸化酵素（TH）によって水酸基が付加され，ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）へと変換される．DOPAはその後，DOPAジオキシゲナーゼ（DOD）によって芳香族環が開裂し，その後自動閉環することでベタラミン酸へと変換される．ベタラミン酸はそれ自身も黄色を呈するが，生体内のアミンやアミノ酸等と縮合することで鮮やかな黄色色素であるベタキサンチンを生じる．このように黄色色素であるベタキサンチンの場合は，2段階の酵素反応を経て合成されることとなる．一方で，赤色のベタシアニンの場合は基本骨格の合成にはさらにもう1段階の酵素反応を必要とする．DOPAがDOPA酸化酵素（DO）によって酸化されることでcyclo-DOPA（cDOPA）が合成される．このcDOPA（あるいはその誘導体）がベタラミン酸と縮合した場合に，赤色系統のベタシアニンが生成する．2012年に赤ビートからシトクロムP450ファミリーに属するCYP76AD1がDOをコードする遺伝子として報告された⁽¹²⁾12) G. J. Hatlestad, R. M. Sunnadeniya, N. A. Akhavan, A. Gonzalez, I. L. Goldman, J. M. McGrath & A. M. Lloyd: Nat. Genet., 44, 816 (2012).．その後，CYP76AD1はDO活性のみならず，TH活性を有することが判明した．一方，これに非常によく似た遺伝子であるCYP76AD5やCYP76AD6がTH活性のみを有する酵素遺伝子として同定された^{(13, 14)}13) G. Polturak, D. Breitel, N. Grossman, A. Sarrion-Perdigones, E. Weithorn, M. Pliner, D. Orzaez, A. Granell, I. Rogachev & A. Aharoni: New Phytol., 210, 269 (2016).14) R. Sunnadeniya, A. Bean, M. Brown, N. Akhavan, G. Hatlestad, A. Gonzalez, V. V. Symonds & A. Lloyd: PLoS One, 11, e0149417 (2016).．DODに関しては，2005年にマツバボタンにおいて遺伝子が単離され⁽¹⁵⁾15) L. Christinet, F. X. Burdet, M. Zaiko, U. Hinz & J. P. Zrÿd: Plant Physiol., 134, 265 (2004).，その後オシロイバナ由来のDODについて，組換え酵素活性が示された⁽¹⁶⁾16) N. Sasaki, Y. Abe, Y. Goda, T. Adachi, K. Kasahara & Y. Ozeki: Plant Cell Physiol., 50, 1012 (2009).．なお，ベタシアニンの場合は，基本骨格がグルコースで修飾されているため，さらに糖転移酵素が必要となる．糖転移に関わる酵素としてcDOPAを基質とする酵素と，基本骨格であるベタニジンを基質とする酵素が報告されている^{(17, 18)}17) N. Sasaki, K. Wada, T. Koda, K. Kasahara, T. Adachi & Y. Ozeki: Plant Cell Physiol., 46, 666 (2005).18) T. Vogt, R. Grimm & D. Strack: Plant J., 19, 509 (1999).．アントシアニンの合成がフェニルアラニンから10段階以上の反応を経て合成されるのとは対象的に，ベタシアニン，ベタキサンチンのいずれも非常に少ない反応で合成されるため，遺伝子工学的に花色を改変したい場合には非常に効率的なツールとなることが期待できる．

図3■ベタレイン生合成経路

化合物をつなぐ矢印の隣にある名称はその反応を触媒する酵素の略称，またはその化学反応を示している．TH, チロシン水酸化酵素；DOD, DOPA 4,5-ジオキシゲナーゼ；DO, DOPA酸化酵素

ベタレイン生合成遺伝子を用いたリンドウの花色改変

青い花の代表とも言えるリンドウは，仏花として人気の高い園芸作物である．しかし，花色のバリエーションに乏しく，園芸品種としては青色の他に，ピンクや白の品種が流通しているのみである．そこで，鮮やかな黄色を呈する色素であるベタキサンチンを合成するリンドウを遺伝子組換え技術によって作成する試みがなされた⁽¹⁹⁾19) M. Nishihara, A. Hirabuchi, F. Goto, Y. Nishizaki, S. Uesugi, A. Watanabe, K. Tasaki, R. Washiashi & N. Sasaki: New Phytol., 240, 1177 (2023).．リンドウの花の青色はアントシアニンによって発色している．そこで，まずアントシアニンによる発色をなくすために，ジヒドロフラボノール還元酵素（DFR）遺伝子をゲノム編集技術によって欠損させ，白色のリンドウを作出した．黄色のベタレイン色素であるベタキサンチンを生産させるために，DOPA合成に必要なTHであるBvCYP76AD6と，ベタラミン酸を合成する酵素遺伝子であるDOPAジオキシゲナーゼ（MjDOD）とを，ゲノム編集で作出した白色リンドウに花特異的プロモーターによって発現するように導入した．その結果，鮮やかな黄色花色をもつ園芸リンドウを作出することに成功した（図4図4■分子育種学的手法で作出された黄色リンドウ（福井県立大学西原昌宏博士提供））．本研究により，アントシアニンを合成するリンドウにおいて，本来排他性をもつはずのベタレインを花で合成できることが実証された．このような植物種および排他性を越えた色素合成の他の研究例として，タバコにベタレインを合成させた報告がある⁽²⁰⁾20) T. Nakatsuka, E. Yamada, H. Takahashi, T. Imamura, M. Suzuki, Y. Ozeki, I. Tsujimura, M. Saito, Y. Sakamoto, N. Sasaki et al.: Sci. Rep., 3, 1970 (2013).．アントシアニンとベタレインの両方を合わせもつ植物は従来の育種方法では作出することができない．しかし，遺伝子組換え技術を利用した分子育種では交配できない種や，植物以外の生物の遺伝子を利用することが可能となる．このようにバイオテクノロジー技術を駆使することによって，これまでにない花色をもつ花きが開発され実用化されている．遺伝子組換えの花きを日本国内で栽培，流通，販売させるには環境影響評価等が義務付けられており，多大な労力とコストおよび時間を要する．しかしながら，本研究で示したように，たった2つの外来遺伝子の導入でこれまでにない鮮やかな黄色の園芸品種が作出できたことの利点は大きい．今後は他の植物においても多様な色彩をもつ品種が作出されることが期待される．

図4■分子育種学的手法で作出された黄色リンドウ（福井県立大学西原昌宏博士提供）

遺伝子組換えによってこれまでにない鮮やかな黄色を示した．遺伝子組換え実験用の実験室内で栽培したものである．

おわりに

我々の身の回りは様々な園芸花き品種で彩られている．これらは育種家の絶え間ない努力によって育成されてきた結果である．近年では種を超えた遺伝資源利用が可能となり，分子育種学的手法によってそれまで地球上に存在しなかった園芸品種が作出され流通している．青いバラ，青いカーネーション，青いコチョウランなど，付加価値を高めることで市場を開拓している．一方で，市場規模の小さな園芸種では，分子育種で開発した場合コストが見合わず，従来育種を利用せざるを得ない．しかし，本稿で紹介したように遺伝子情報や色素分析情報を活用することによって，従来では利用できなかった原種や品種が価値の高い遺伝資源となり得ることが示された．また，育種の方向性を予想しながら各種の分析情報利用することで育種年数を大幅に短縮することも可能である．今後は分子育種手法とともに遺伝子解析支援型の従来育種によって花き園芸産業がさらに活性化することが期待される．