はじめに

アレルギーとは，卵や大豆等の食品や花粉等の生体にとって本来無害な物質に対して，免疫系が過剰に反応して様々な症状が生じることをいう．アレルギーの発症には，免疫細胞の働きが大きく関与している．T細胞の一種であるTh1細胞とTh2細胞がお互いを制御し，バランスが保たれることで免疫系は正常に機能しているが，アレルギーにおいては，Th2細胞が優位であることが知られており，Th2細胞から産生されるサイトカインによって過剰に産生された抗体（IgE抗体）が，花粉やダニ，ハウスダスト等の抗原に反応してアレルギーを発症する．最近では，T細胞の一種である制御性T細胞（Treg）は，Th1細胞やTh2細胞等を調節することで免疫バランスを整え，過剰なアレルギー反応や炎症反応を抑える働きを有することも報告されている⁽¹⁾1) M. Noval Rivas & T. A. Chatila: J. Allergy Clin. Immunol., 138, 639 (2016).．

代表的なアレルギーとして，季節性アレルギー性鼻炎（花粉症），通年性アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎や食物アレルギー等が挙げられるが，近年，先進諸国を中心にアレルギー疾患患者の増加が大きな社会問題となっている．しかし，現在のところ有効な根治療法は無く，薬剤による対症療法が主流である．このような背景の中，抗アレルギー作用を有する機能性食品への関心が高まっており，様々な食品素材に関する研究が進められている．特に乳酸菌については，多くの研究機関からアレルギー症状軽減作用に関する臨床試験結果が報告されている⁽²⁾2) I. A. Güvenç, N. B. Muluk, F. Ş. Mutlu, E. Eşki, N. Altıntoprak, T. Oktemer & C. Cingi: Am. J. Rhinol. Allergy, 30, 157 (2016).．また，乳酸菌以外の食品素材としては，柑橘類に含まれるヘスペリジンなどのフラボン類が培養細胞系や動物試験系で抗炎症作用や抗アレルギー作用を示す可能性が報告されている⁽^{3, 4)}3) D. Wei, X. Ci, X. Chu, M. Wei, S. Hua & X. Deng: Inflammation, 35, 114 (2012).4) J. A. Emim, A. B. Oliveira & A. J. Lapa: J. Pharm. Pharmacol., 46, 118 (1994).．これらは何れもアレルギー疾患の根治療法への応用が期待される食品素材であるが，併用により柑橘類に含まれるフラボン類と乳酸菌の効果が相加的にはたらき，高い抗アレルギー作用を示す可能性が考えられる．そこで，我々は乳酸菌と柑橘果汁を組み合わせた飲料を開発し，アレルギー疾患に対する効果検証試験を実施したので本稿で解説する．

乳酸菌の探索

乳酸菌は一般に酸が存在する低pH環境下では増殖性が悪く，死滅する場合もある．そのため，乳酸菌の食品への主な利用形態は発酵乳のように，pHが中性域の素材を発酵させるのが主流である．一方，柑橘果汁は低pHであるため，柑橘果汁の発酵に用いる乳酸菌の条件としては，低pH環境下でも良好に増殖できることが前提となる．このような乳酸菌を探索した結果，Lactiplantibacillus plantarumに属する菌株が柑橘果汁中で優れた増殖性を示すことがわかった．中でもLactiplantibacillus plantarum YIT 0132（LP0132）は，in vitro評価系において免疫細胞からの抗炎症性サイトカイン（IL-10）の誘導能が高いことが確認されたことから，アレルギー反応を抑制する働きを有する可能性が期待された⁽⁵⁾5) N. Harima-Mizusawa, T. Iino, N. Onodera-Masuoka, N. Kato-Nagaoka, J. Kiyoshima-Shibata, A. Gomi, H. Shibahara-Sone, M. Kano, K. Shida, M. Sakai et al.: Biosci. Microbiota Food Health, 33, 147 (2014).．

発酵果汁飲料のアレルギーに対する有効性

そこで本菌株を用いて柑橘果汁を発酵させた飲料（以下，発酵果汁飲料）を製造し，各種アレルギー疾患への有効性を検証する以下の介入試験を実施した．

1．スギ花粉症に対する効果検証試験（花粉症試験I）⁽⁵⁾

スギ花粉飛散時期（2010年2～4月）に花粉症自覚症状を有する成人を対象とし，単盲検プラセボ対照並行群間試験を実施した．被験者42名を2群に分け，発酵果汁飲料（バレンシアオレンジ果汁をLP0132で発酵させた飲料）もしくはプラセボ飲料（未発酵のバレンシアオレンジ果汁）を1日1本8週間摂取させ，日本アレルギー性鼻炎標準QOL調査票（JRQLQ NO.1）を基にしたアンケート調査⁽⁶⁾6) K. Okubo, Y. Kurono, K. Ichimura, T. Enomoto, Y. Okamoto, H. Kawauchi, H. Suzaki, S. Fujieda & K. Masuyama; Japanese Society of Allergology: Allergol. Int., 69, 331 (2020).により，花粉症自覚症状およびQOL障害度を評価した．その結果，試験期間中にプラセボ群では花粉飛散に伴いかゆみスコア（目のかゆみ，鼻のかゆみ，皮膚のかゆみのスコアの合計）が増加したが，発酵果汁群では悪化の程度が緩やかに推移し，スギ花粉飛散ピーク直後において，発酵果汁群は有意に低値を示した（図1図1■発酵果汁飲料の摂取が症状スコアに与える影響）．

図1■発酵果汁飲料の摂取が症状スコアに与える影響

摂取前から摂取期間後までのかゆみスコアの経時変化を示した．*: p＜0.05（Wilcoxon順位和検定，発酵果汁群vs.プラセボ群）．文献5より改変転載．

2．スギ花粉症に対する効果検証試験（花粉症試験II）⁽⁷⁾

発酵果汁飲料の花粉症に対する有効性の再現性を確認するため，2017年のスギ花粉飛散時期（2～4月）に，花粉症の有症者100名を2群に分け，各群に発酵果汁飲料（温州みかん果汁をLP0132で発酵させた飲料）またはプラセボ飲料（未発酵の温州みかん果汁飲料）を1日1本8週間継続摂取させた．花粉症症状の評価は，JRQLQ No.1に基づいたアンケート調査にて行った．

その結果，発酵果汁群の摂取1, 2週目の総合症状スコアの変化量（以下，⊿総合症状スコア）および総合鼻症状スコアの変化量（以下，⊿総合鼻症状スコア）がプラセボ群と比較して有意に低値を示した（図2A, B図2■発酵果汁飲料の摂取による症状軽減）．摂取期間全体のスコアを用いて二元配置分散分析を実施したところ，発酵果汁群の⊿総合鼻症状スコアは，プラセボ群と比較して有意に低値を，⊿総合症状スコアは低値傾向を示した（図2A, B図2■発酵果汁飲料の摂取による症状軽減）．以上の結果より，発酵果汁飲料の摂取によるスギ花粉症症状の軽減効果が確認された．

図2■発酵果汁飲料の摂取による症状軽減

（A）⊿総合症状スコア，（B）⊿総合鼻症状スコア，（C）⊿総合目症状スコア．平均値±標準偏差．各時点間での群間比較（†: p＜0.1, *: p＜0.05, t-検定）．摂取期間全体での比較（‡: p＜0.1, §§: p＜0.01, 二元配置分散分析）．文献7より改変転載．

3．通年性アレルギー性鼻炎に対する効果検証試験⁽⁸⁾

通年性アレルギー性鼻炎の有症者を対象とし二重盲検プラセボ対照並行群間比較試験を実施した．被験者33名を2群に分け，発酵果汁飲料（温州みかん果汁をLP0132で発酵させた飲料）またはプラセボ飲料（未発酵の温州みかん果汁飲料）を8週間継続摂取させた（発酵果汁群17名，プラセボ群16名）．鼻炎症状総合スコアおよび各鼻炎症状スコアについて，摂取前と摂取期間における同スコアの変化量を被験者毎に算出し，群間比較を行った．その結果，発酵果汁群ではプラセボ群と比べて，鼻炎症状総合スコアおよび鼻閉スコアが有意に改善した（図3図3■発酵果汁飲料の通年性アレルギー性鼻炎に与える影響）．また，本稿ではデータを示していないが，当試験ではベースラインと摂取期間との群内比較も行っており，発酵果汁群ではくしゃみ，鼻閉，鼻の痒みなど複数項目で有意な改善が認められた．一方，プラセボ群でもベースラインと比較してスコアが軽減した項目が一部認められたことから，柑橘果汁自体にも症状軽減作用がある可能性も考えられたが，このことを証明するには未摂取時との比較など，より詳細な検討が必要と考えられる．

図3■発酵果汁飲料の通年性アレルギー性鼻炎に与える影響

鼻炎症状総合スコアおよび鼻閉スコアの摂取前から8週間摂取後の症状スコアの変化量を群間比較した．平均値±標準偏差．t-検定（発酵果汁群vs.プラセボ群）．*; p＜0.05. 文献8より改変転載．

4. 機能性表示食品のガイドライン該当者を対象とした本飲料の有効性

2015年に消費者の健康増進を目的とした「機能性表示食品制度」が施行された．本制度は，事業者が製品の安全性データと健常者を対象とした検証試験データを取得し，得られた結果を根拠データとして事前に届出することにより，ヘルスクレームを謳うことが可能となる制度である．

アレルギー領域については，2019年から抗アレルギー薬の使用頻度により区分された健常者と軽症者を対象とした介入試験の結果を根拠データとして用いることが可能となった．そこで，先述した試験についてガイドラインとの適合性を確認したところ，通年性アレルギー性鼻炎有症者を対象とした試験については，ガイドラインに合致するため，機能性表示の根拠データとして使用できると考えられた．一方，花粉症有症者を対象とした試験については，花粉症試験Iは薬使用量の調査が不十分であることからガイドラインに適合しないと判断された．花粉症試験IIは，服薬制限をしておらず，被験者の中にガイドラインで示された健常者や軽症者に該当しない被験者（常時抗アレルギー薬を摂取している者）が一部含まれていたため，ガイドラインの定義に基づく被験者のデータを再解析し，花粉症症状やQOLに対する有効性を検証することとした⁽⁹⁾9) 久保田憲広，鈴木修一，柿山明香，椎木順子，中森一樹，五十嵐友季，志田　寛，水澤（播摩）直美：薬理と治療，49, 1439 (2021).．

花粉症試験IIの全被験者100名のうち，ガイドライン該当者は健常者（抗アレルギー薬を摂取していない者）：48名，軽症者（抗アレルギー薬を時々摂取している者）：45名の計93名であった．93名の内訳は発酵果汁群44名，プラセボ群49名であった．

解析の結果，発酵果汁群の摂取1, 2週目の⊿総合症状スコア，⊿総合鼻症状スコアはプラセボ群と比較して有意に低値を示した（図4A, B図4■各種症状スコアの推移）．総合QOL障害度スコアの変化量（⊿総合QOL障害度スコア）を評価したところ，発酵果汁群では2～4週目においてプラセボ群と比較して有意に低値を示した（図4C図4■各種症状スコアの推移）．以上より，ガイドライン該当者においても発酵果汁飲料の継続摂取は，花粉症症状の悪化を軽減し，さらにQOLの悪化も抑制することが確認された．

図4■各種症状スコアの推移

（A） ⊿総合症状スコア，（B）⊿総合鼻症状スコア，（C）⊿総合QOL障害度スコア．平均値±標準偏差．各時点間での群間比較（*; p＜0.05, †; p＜0.1, 各時点における薬物スコアを共変量とした共分散分析）．摂取期間全体での群間比較（§: p＜0.05,§§: p＜0.01, 二元配置分散分析）文献9より改変転載．

発酵果汁飲料の製品化と機能性表示の取得

抗アレルギー効果が期待できる乳酸菌の探索開始から約10年，柑橘果汁をLP0132で発酵させた発酵果汁飲料は，数多くの安全性試験をクリアし，2015年からテスト販売を開始し，2018年には全国展開した．その後，花粉症や通年性アレルギー性鼻炎について，機能性表示食品ガイドライン該当者を対象とした試験データをもとに，発酵果汁飲料に含まれるLP0132の摂取が花粉，ホコリ，ハウスダスト等による鼻の不快感軽減効果を有するとして2022年8月に機能性表示食品の届出を行い，同年10月に受理された（消費者庁届出番号H386）．これを受け，2023年2月にリニューアル発売をした．

発酵果汁飲料の作用メカニズムに関する知見

これまでに発酵果汁飲料の飲用試験において，症状スコアのアンケート調査による有効性評価に加えて，血中のアレルギー関連血液パラメーターの測定による作用メカニズムを探る研究も進めてきた．花粉症試験II⁽⁷⁾7) S. Suzuki, N. Kubota, S. Kakiyama, K. Miyazaki, K. Sato & N. Harima-Mizusawa: Allergy, 75, 453 (2020).においてTreg値の変化を調べたところ，プラセボ群では摂取前と比較して，スギ花粉飛散のピーク近辺である摂取4～5週目でTreg値が有意に減少していたことから，Treg値は花粉曝露に伴って低下する可能性が考えられた．一方，発酵果汁群では摂取前後でのTreg値の有意な変化が認められず，摂取4～5週目ではプラセボ群に比べて発酵果汁群のTreg値は，有意に高値を示した（図5A図5■発酵果汁飲料の飲用によるTregの変化およびTregと症状スコアとの関係（花粉症試験II））．先行研究において，アレルギー有症者に乳酸菌を投与した際のTreg値の変化を明確に示した報告はなかったが，本研究ではLP0132によるTreg値の低下抑制作用を捉えることができた．さらに，発酵果汁群の被験者50名について，摂取前に比べて摂取期間中にTreg値が増加したグループ（17名），減少したグループ（33名）に層別し，Treg値と症状緩和作用との関係について探索的に考察した．両グループの症状スコアの変化量を比較した結果，Treg値が増加したグループでは，減少したグループに比べて⊿総合鼻症状スコアが有意に低値を示した（図5B図5■発酵果汁飲料の飲用によるTregの変化およびTregと症状スコアとの関係（花粉症試験II））．一方，プラセボ群でも同様に解析したものの，症状スコアの有意な差は認められなかった．これらの結果は，発酵果汁飲料の鼻症状軽減効果にTregの増加が関与することを裏付ける結果と考えられた．

図5■発酵果汁飲料の飲用によるTregの変化およびTregと症状スコアとの関係（花粉症試験II）

（A）血中Treg値の推移，（B）発酵果汁群におけるTreg増加グループ，減少グループによる層別解析．平均値±標準偏差．各時点間での群間比較（*: p＜0.05, t-検定）．摂取期間全体での比較（§: p＜0.05, 二元配置分散分析）．摂取前と比較した群内比較（#: p＜0.025, ###: p＜0.0005, ボンフェローニ補正したpaired t-検定）．文献7より改変転載．

花粉症試験Iにおいては炎症の指標となる血中の好酸球数がプラセボ群ではスギ花粉飛散後期において増加したのに対し，発酵果汁群では本増加が有意に抑制され，プラセボ群より有意に低値を示した⁽⁵⁾5) N. Harima-Mizusawa, T. Iino, N. Onodera-Masuoka, N. Kato-Nagaoka, J. Kiyoshima-Shibata, A. Gomi, H. Shibahara-Sone, M. Kano, K. Shida, M. Sakai et al.: Biosci. Microbiota Food Health, 33, 147 (2014).．

また通年性アレルギー性鼻炎の有症者を対象とした試験では，摂取前後に血液中のアレルギー関連マーカーを調べたところ，発酵果汁群でのみ，摂取前に比べ摂取8週目で血中Th2, IgE, ECP（好酸球カチオンタンパク質）が有意に低下した（表1表1■通年性アレルギー性鼻炎有症者を対象とした試験における血液中アレルギー関連血液パラメーターの変化）⁽⁸⁾8) N. Harima-Mizusawa, M. Kano, D. Nozaki, C. Nonaka, K. Miyazaki & T. Enomoto: Benef. Microbes, 7, 649 (2016).．

これらの知見を考え合わせると，発酵果汁飲料の摂取によりTreg細胞数が維持され，その結果Tregのはたらきにより，Th2やその下流に位置する好酸球等のはたらきが抑制され，アレルギー症状が軽減した可能性が考えられた．

表1■通年性アレルギー性鼻炎有症者を対象とした試験における血液中アレルギー関連血液パラメーターの変化
項目	試験飲料	飲用前	飲用8週
総IgE （IU/mL）	被験飲料	316.4±97.6	289.7±87.7*
総IgE （IU/mL）	プラセボ飲料	426.9±181.6	389.2±157.6
ECP （µg/L）	被験飲料	8.34±1.34	5.17±0.65*
ECP （µg/L）	プラセボ飲料	7.64±1.73	5.83±1.69
Th2 （％）	被験飲料	0.90±0.09	0.55±0.08**
Th2 （％）	プラセボ飲料	0.78±0.09	0.68±0.14
平均値土標準誤差　1標本t検定　p＜0.05, * p＜0.01

おわりに

近年，乳酸菌の機能性に関する研究エビデンスの蓄積は目覚ましく，整腸作用以外の様々な作用が明らかになってきている．アレルギー患者数の増加に伴い，乳酸菌のアレルギーに対する抑制効果も新たな機能性として着目されている．本稿では柑橘果汁（温州みかん果汁等）をLP0132で発酵させた発酵果汁飲料の開発から機能性表示食品の取得に至る経緯や，花粉症および通年性アレルギー性鼻炎の有症者を対象とした有効性試験の結果を中心に紹介した．今後，本飲料のアレルギーへの有効性や作用メカニズムに対する知見を蓄積していくことにより，アレルギー症状を有する方々の生活の質（QOL）の向上に役立てればと考える．