1. 腸内細菌叢と健康

ヒトの腸内には数百種類，40兆個以上にも上る多種多様な細菌が棲みついており，細菌同士あるいは宿主と互いに影響を及ぼし合いながら複雑な「腸内細菌叢」を形成している．腸内細菌は，ビタミンなどの必須栄養素の産生，免疫機構の恒常性維持，病原性細菌の増殖抑制など，さまざまな生理活性を有しており，炎症性腸疾患などの腸の疾患だけでなく，非アルコール性脂肪性肝疾患や糖尿病，肥満などの代謝疾患，さらにはアルツハイマー病や自閉スペクトラム症などの精神疾患とも関連することが明らかになっている^{(1, 2)}1) I. Sekirov, S. L. Russell, L. C. M. Antunes & B. B. Finlay: Physiol. Rev., 90, 859 (2010).2) L. H. Morais, H. L. Schreiber 4th & S. K. Mazmanian: Nat. Rev. Microbiol., 19, 241 (2021).．

2. 乳児期の腸内細菌叢とビフィズス菌

受胎してから出生後2歳の誕生日を迎えるまでの人生最初の1000日を指す“first 1000 days”は，代謝，内分泌，神経，免疫などの発達に加え，腸内細菌叢の確立にとっても重要な時期とされている．乳児期の腸内細菌叢は，在胎期間や母親の腸内細菌叢，分娩形態，栄養方法，病院環境，家族構成などさまざまな因子に影響を受けながら，生後2～3年間は大きく変動する⁽³⁾3) M. F. Laursen, M. I. Bahl & T. R. Licht: FEMS Microbiol. Rev., 45, 1 (2021).．経腟分娩で生まれた正期産児の多くでは，生後数週間でビフィズス菌優勢な腸内細菌叢が形成されるが，ビフィズス菌の検出率や菌数も栄養方法や抗生物質の使用といった各因子の影響を受けることが知られている．ビフィズス菌は，腸管バリア機能の向上や病原菌の腸管定着抑制，正常な免疫機能発達への寄与など，乳児の健康維持に極めて重要な役割を果たすと考えられている^{(4, 5)}4) S. C. Leahy, D. G. Higgins, G. F. Fitzgerald & D. van Sinderen: J. Appl. Microbiol., 98, 1303 (2005).5) D. Di Gioia, I. Aloisio, G. Mazzola & B. Biavati: Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 563 (2014).．さらに，乳児期のビフィズス菌の存在が小児期の健康に影響することも指摘されている．例えば，出生から7歳児までを追跡調査した前向き研究からは，7歳時点で過体重の児は正常体重児と比較して，6ヵ月時および12ヵ月時の糞便中ビフィズス菌数が有意に低く，特にBifidobacterium longumとBifidobacterium breveが低かったことが示された⁽⁶⁾6) M. Kalliomäki, M. C. Collado, S. Salminen & E. Isolauri: Am. J. Clin. Nutr., 87, 534 (2008).．さらに，乳児期のビフィズス菌の存在量が小児期の湿疹やアレルギー性疾患リスクと関連することや，小児期の発達に影響すると考えられる神経の発達にも影響することが示唆されている．

3. ヒト腸管に棲息するビフィズス菌の特徴

現在，Bifidobacterium属には100以上の菌種や亜種が存在する．ビフィズス菌は主にヒトやその他哺乳類，鳥類，昆虫などの腸管に棲息していることが知られるが，興味深いことに菌種・亜種ごとに棲息する場所が異なる．主にヒト腸管に棲息するビフィズス菌（Human-Residential Bifidobacteria; HRB）は10菌種程度であり，さらに乳児と成人で棲息する菌種が異なり（それぞれ乳児型HRB，成人型HRB），乳児型HRBとしては，B. breve, B. longum（subsp. longumおよびsubsp. infantis），Bifidobacterium bifidumがあげられる（図1図1■ビフィズス菌の棲息場所の違い）．ヒト科に属するヒト，チンパンジー，ボノボ，ゴリラの腸内細菌叢を調査したMoellerらの研究からは，ビフィズス菌とそれぞれの宿主が，1,500万年以上にもわたり共進化してきたことが示唆されており⁽⁷⁾7) A. H. Moeller, A. Caro-Quintero, D. Mjungu, A. V. Georgiev, E. V. Lonsdorf, M. N. Muller, A. E. Pusey, M. Peeters, B. H. Hahn & H. Ochman: Science, 353, 380 (2016).，各々の宿主の腸管に適応しながらそれぞれ特徴を有した菌種に進化してきたことが推測される．HRBとヒトに棲息しないビフィズス菌（Non-HRB）を比較したわれわれの研究から見えてきたHRBの特徴について，炭水化物の資化性，代謝産物の観点から紹介する．

図1■ビフィズス菌の棲息場所の違い

（日本農芸化学会2023年度受賞講演要旨集より作図）

3.1 乳児型HRBと母乳との親和性

プロバイオティクスとして乳製品などに広く利用されている3菌種，すなわち乳児型HRBであるB. longum（subsp. longum, subsp. infantis）およびB. breveと，Non-HRBであるBifidobacterium animalis（subsp. animalis, subsp. lactis）の計49株の比較ゲノム解析を行った結果，乳児型HRBである2菌種の間で共通している遺伝子数が多い一方，乳児型HRBいずれかとNon-HRBであるB. animalisの間で共通している遺伝子数が少なく，棲息環境によって特徴的な遺伝子構成を有していることが示唆された⁽⁸⁾8) T. Odamaki, A. Horigome, H. Sugahara, N. Hashikura, J. Minami, J. Z. Xiao & F. Abe: Int. J. Genomics, 2015, 567809 (2015).．具体的に，乳児型HRBにはヒトミルクオリゴ糖（Human Milk Oligosaccharides; HMOs）の資化に関連する遺伝子（HMOsの取り込み・分解に関連する遺伝子，フコシダーゼ，シアリダーゼなどのグリコシダーゼ遺伝子）が多く分布していた．実際に，乳児型HRBは，Non-HRBにはないHMOs資化能を有していることがin vitro試験で示されている．上記の結果から，高いHMOs資化能を持つ乳児型HRBは，母乳中においてもNon-HRBと比較して増殖速度が速いのではないかと考えられたため，HRBおよびNon-HRBの計37株を対象とした母乳中での増殖性試験を実施した⁽⁹⁾9) J. Minami, T. Odamaki, N. Hashikura, F. Abe & J. Z. Xiao: Benef. Microbes, 7, 53 (2016).．その結果，乳児型HRBが増殖した一方で，Non-HRBではほとんどの菌株が増殖を示さないどころか，検出限界以下にまで菌数が低下してしまった．母乳にはすべてのビフィズス菌が資化可能な乳糖が豊富に含まれていることから，栄養成分が不足したのではなく，母乳に含まれる抗菌活性因子によってNon-HRBの生育が阻害された可能性が考えられた．母乳中にはラクトフェリンなどさまざまな抗菌活性因子が含まれているが，なかでもリゾチームは他の哺乳類と比較してヒト母乳に数千倍多く含まれている．そこで，上記母乳中での増殖性試験に供した菌株のリゾチーム耐性を測定したところ，母乳中での増殖能とリゾチーム耐性が良く相関しており，Non-HRBが母乳中のリゾチームにより殺菌されていることが示唆された．

以上の通り，乳児型HRBは高いHMOs資化能に加えて，リゾチームへの耐性機構を獲得し，母乳との親和性を高めることで乳児腸管という特殊な環境に高度に適応してきたと考えられた（図2図2■乳児型HRBと母乳との親和性）．

図2■乳児型HRBと母乳との親和性

4. 乳児型HRBによる低出生体重児腸内細菌叢の改善作用

われわれは，上述の研究結果などからヒトにはHRBが最も適していると考え，乳児から分離したビフィズス菌を中心としたさまざまなHRB菌株の研究開発を進めている．ここでは，小児科領域の疾患予防・健康維持において数多くの研究成果が報告されているB. breve M-16Vの乳児期の腸内細菌叢への影響について紹介する．

健康な乳児の腸管から分離されたB. breve M-16Vは，アメリカ食品医薬品局（FDA）から育児用粉ミルクを含む食品に対するGRASステータス（GRAS No.453–455）を取得しており，育児用粉ミルクを含むいくつかの国内外の製品に配合されている⁽¹²⁾12) C. B. Wong, N. Iwabuchi & J. Z. Xiao: Nutrients, 11, 1724 (2019).．当菌株はこれまでに，早産児や低出生体重児を含む乳児に対して，腸内細菌叢改善作用，感染防御作用，壊死性腸炎発症リスク低減作用，アレルギー症状緩和作用などを示すことが報告されている．われわれはB. breve M-16Vの持続的な作用を調査するため，B. breve M-16V投与終了後の定着性および腸内細菌叢への影響を評価した⁽¹³⁾13) A. Horigome, K. Hisata, T. Odamaki, N. Iwabuchi, J. Z. Xiao & T. Shimizu: Front. Microbiol., 12, 610080 (2021).．低出生体重児に生後からNICU入院中毎日B. breve M-16V（10億／日）を投与したところ，投与終了後数週間経過した時点においてもB. breve M-16Vが腸管内に定着していることが明らかになった（図3図3■投与終了後数週間後のM-16Vの定着性）．さらにM-16V投与群では非投与群と比較してビフィズス菌が属するActinomycetota（旧Actinobacteria）門の占有率が高く，大腸菌などが属するPseudomonadota（旧Proteobacteria）門の占有率が低いことが明らかになり（図4図4■M-16Vによる腸内細菌叢改善作用），B. breve M-16V投与による持続的な腸内細菌叢改善作用が示された．B. breve M-16Vの持続的な定着や腸内細菌叢改善作用は，乳児，特に低出生体重児の腸内細菌叢が不安定であることや，B. breve M-16Vが母乳との親和性が高い乳児型HRBであることに起因する可能性があるとわれわれは考えている．

図3■投与終了後数週間後のM-16Vの定着性

**P＜0.01（Mann–Whitney U-test）（日本農芸化学会2023年度受賞講演要旨集より作図）

図4■M-16Vによる腸内細菌叢改善作用

**P＜0.01（Mann–Whitney U-test）（日本農芸化学会2023年度受賞講演要旨集より作図）

前述の通り，腸内細菌叢が確立されていく“first 1000 days”は，適切な腸内細菌叢への介入により，児を健康な成長へと導くための非常に重要な時期である．特に低出生体重児は腸内へのビフィズス菌の定着が遅く，また健康に係るリスクが高いことが知られている．それゆえに，われわれの研究から示されたB. breve M-16V投与による持続的な定着および腸内細菌叢改善作用は，未来の多くの子どもたちの健康に貢献するものと期待している．

1. 加齢による腸内細菌叢の変化

乳児の腸内細菌叢は，さまざまな影響を受けながら各腸内細菌の組成が大きく変動する時期を経て，2～3歳にはかなり成人に近い腸内細菌叢へと収束する．0歳から104歳までの健康な日本人を対象に加齢に伴う腸内細菌叢組成の変化を調査した研究からは，離乳前は優勢であったビフィズス菌が離乳を境に減少し，10～50代では10～20％程度で比較的安定するものの，60代以降にさらに減少することが示されている⁽¹⁴⁾14) T. Odamaki, K. Kato, H. Sugahara, N. Hashikura, S. Takahashi, J. Z. Xiao, F. Abe & R. Osawa: BMC Microbiol., 16, 90 (2016).．その他の加齢に伴う変化としては，BlautiaやFaecalibacteriumといった酢酸や酪酸を産生する細菌群の減少，およびBacteroides, Eubacterium, Clostridiaceae, Enterobacteriaceaeなどの増加が認められた．さらに吉本らは，典型的な高齢者型の腸内細菌叢を有する高齢者と，成人型の腸内細菌叢を有する高齢者との間で糞便の代謝産物を比較し，動脈硬化や大腸がんといった加齢性疾患との関連性が報告されているcholineやtrimethylamine, N8-acetylspermidineなどの代謝産物のレベルが前者の糞便中で有意に高いことを報告した⁽¹⁵⁾15) S. Yoshimoto, E. Mitsuyama, K. Yoshida, T. Odamaki & J. Z. Xiao: Gut Microbes, 13, 1 (2021).．他の研究では，加齢に伴う腸内細菌叢の攪乱が炎症を促進することがマウスで示されており，適切な介入により高齢者型の腸内細菌叢を成人型に変更する，あるいは成人型を維持することが加齢性疾患の予防に繋がる可能性が示されている．

2. 高齢者の腸内細菌叢の制御

われわれの研究グループは，糞便培養による人工腸管モデルを用いて，加齢に伴い減少する菌群を増加させるようなプレバイオティクスの探索を行っている．その取り組みの中で明らかになったHMOsの主要成分である2′-フコシラクトース（2′-fucosyl-lactose; 2′-FL）のBlautia増殖作用について紹介する．

Blautiaは，抗菌活性や抗炎症作用を有し，マウスに投与した研究からは肥満や2型糖尿病を改善する作用が確認されており⁽¹⁶⁾16) K. Hosomi, M. Saito, J. Park, H. Murakami, N. Shibata, M. Ando, T. Nagatake, K. Konishi, H. Ohno, K. Tanisawa et al.: Nat. Commun., 13, 4477 (2022).，ヒトに有用な腸内細菌であると考えられている．7名の被験者より採取した糞便を用いた糞便培養により，さまざまなプレバイオティクス素材を検討したところ，2′-FLを単一の糖源としたときに，Blautia wexleraeが増加した⁽¹⁷⁾17) R. Murakami, N. Hashikura, K. Yoshida, J. Xiao & T. Odamaki: Food Res. Int., 144, 110326 (2021).．しかし，7名中5名（レスポンダー）では糞便細菌叢中のB. wexleraeが大幅に増加したのに対し，他の2名（ノンレスポンダー）では減少し，2′-FLのB. wexlerae増殖作用には糞便ドナーによる個人差があることが明らかになった．そこで，その要因を解明すべく解析を実施した⁽¹⁸⁾18) A. Horigome, N. Hashikura, K. Yoshida, J. Xiao & T. Odamaki: Front. Microbiol., 13, 913624 (2022).．2′-FLの利用には，2′-FLをフコースと乳糖に分解するGH95α-L-フコシダーゼが重要であるため，各被験者の培養前の糞便のメタゲノムデータにおけるフコシダーゼ遺伝子の存在量や種類を解析した．その結果，レスポンダーの糞便中には，菌体内フコシダーゼ遺伝子と比較して菌体外フコシダーゼ遺伝子が多く，ノンレスポンダーではその逆であった．この時B. wexlerae由来のGH95α-L-フコシダーゼ遺伝子は検出されなかったことから，レスポンダー糞便中のB. wexleraeは，他の細菌が2′-FLを菌体外で分解して生じたフコースや乳糖を利用して増殖したと推測された．実際に，B. wexleraeは2′-FLを利用して増殖ができない一方で，フコースや乳糖を利用して増殖できることが確認された．ノンレスポンダー糞便中には，菌体内フコシダーゼを保有する細菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）が多く検出されたことから，2′-FLがそれらの細菌に取り込まれて菌体内で分解・利用されたと推測された．続いて，菌体外フコシダーゼを保有する細菌を添加することによってノンレスポンダーの糞便中でも2′-FLでB. wexleraeが増殖するかを検証した．菌体外フコシダーゼを持つB. bifidum MCC2030を添加し，ノンレスポンダーの糞便を2′-FLを単一の糖源とした培地で培養した結果，非添加と比較して，B. wexleraeが大幅に増加することが示された．以上の結果から，2′-FLによるB. wexleraeの増殖メカニズム（図5図5■2′-フコシルラクトースによるBlautia増殖作用メカニズム）が明らかになると同時に，加齢による腸内細菌叢の変化を，2′-FLや2′-FLとB. bifidumの組み合わせにより制御できる可能性が示された．

図5■2′-フコシルラクトースによるBlautia増殖作用メカニズム