自然抗体による内因性抗原の認識機構の解析

抗体は病原体やウイルスなどに結合し，体内から排除することで感染を防ぐ分子であり，血液中や腸管内に存在する．自然免疫系の抗体である自然抗体は主にIgMであり，抗原結合部位に変異を持たず，病原体やウイルスなどの様々な外因性抗原を認識できる広範な特異性を備え持っている⁽¹³⁾13) M. R. Ehrenstein & C. A. Notley: Nat. Rev. Immunol., 10, 778 (2010).．自然抗体が病原体などの異物のみでなく，死細胞やDNAなどの変性した自己に由来する「内因性抗原」を認識することがこれまでに確認されてきたが，認識メカニズムや疾患との関わりなどについては不明な点も多い⁽¹⁴⁾14) N. E. Holodick, N. Rodríguez-Zhurbenko & A. M. Hernández: Front. Immunol., 8, 872 (2017).．

筆者らは，特にAGEsに着目した検討を行った．AGEsは内因性抗原として自然免疫系分子に認識されることがよく知られており，特にRAGE, SR-B1などのマクロファージに発現するスカベンジャー受容体に結合して炎症を誘導することで，糖尿病などの悪化につながることが予想されている⁽¹⁵⁾15) C. Ott, K. Jacobs, E. Haucke, A. N. Santos, T. Grune & A. Simm: Redox Biol., 2, 411 (2014).．しかし，自然抗体による認識については報告がなかったため，これを明らかにするべく検討を行った．結果として，疾患を持たない通常マウスの血清中においてAGEsを認識するIgM自然抗体が存在することが確認された⁽¹⁶⁾16) M. Chikazawa, N. Otaki, T. Shibata, H. Miyashita, Y. Kawai, S. Maruyama, S. Toyokuni, Y. Kitaura, T. Matsuda & K. Uchida: J. Biol. Chem., 288, 13204 (2013).．また，AGEsを認識する抗体について，ハイブリドーマを作製し，モノクローナル抗体を用いて解析を行ったところ，抗AGEs抗体の中にはAGEsとDNAの両方に結合するものが確認され，さらにアポトーシス細胞に結合性を持つものも確認された．このように，得られた抗体はAGEsやDNAなど様々な分子を認識することのできる「多重交差性抗体」であることが明らかとなった．これはAGEsやDNAに結合する抗体がそれぞれ存在する可能性を否定するものではないが，AGEs（タンパク質），DNA（核酸），死細胞など構造的には異なると考えられる多様な種類の内因性抗原を1つの抗体が認識できる可能性を示していた．

なお，この検討の際にはAGEsをアジュバント（免疫賦活化剤）とともに腹腔投与し，AGEsに対する抗体価が上昇したマウスよりハイブリドーマを取得した．得られたハイブリドーマが産生する抗体のシークエンス解析を行ったところ，germlineとの相同性が高く，変異を持たない自然抗体である可能性が高いと考えられた．AGEsを免疫することで自然抗体産生が活性化され，自然抗体を産生するハイブリドーマが取得されたことが予想される．

自然抗体がなぜこのような多重交差性を持つか，どのようなメカニズムで多様な抗原認識が可能になっているのかについてさらに検討を進めたところ，内因性抗原の表面電荷が関与していることが予想された．酸化タンパク質の生成の際，リジンやアルギニン，ヒスチジンなどの求核性アミノ酸が特に修飾されやすく，これらの側鎖が修飾され，正電荷が打ち消されることで，酸化タンパク質表面の電荷は未修飾のタンパク質と比較して負に傾くことが知られる．実際に，分子の表面電荷を表すゼータ電位がAGEsの修飾度（反応させた糖の濃度や反応日数）に比例して低下することに加え，AGEsの電荷の低下と抗体との反応性には相関が見られることが確認された．また，分子同士の静電的な相互作用は反応液に高濃度の塩化ナトリウムを添加することで打ち消されるが，自然抗体とAGEsの相互作用もNaClを添加すると完全に抑制された．さらに，リジン残基のアセチル化はリジンの電荷を打ち消す翻訳後修飾であるが，リジン残基を高度にアセチル化したアセチル化タンパク質も抗AGEs自然抗体に認識されたことから，自然抗体による認識にはAGEsに存在する特定の修飾構造が重要なのではなく，電荷が重要であることが予想される．DNAやアポトーシス細胞も表面電荷が低いことから，電荷を介した抗原認識はこれら分子を共通して認識する上で重要な機構であると考えられる．

電荷を用いた相互作用については抗体，スカベンジャー受容体，補体などにおいて報告されており，糖鎖を有する微生物，ウイルスなどの認識においても利用されると考えられる^{(17, 18)}17) Y. Chao, P. P. Karmali, R. Mukthavaram, S. Kesari, V. L. Kouznetsova, I. F. Tsigelny & D. Simberg: ACS Nano, 7, 4289 (2013).18) A. J. Bradley, D. E. Brooks, R. Norris-Jones & D. V. Devine: Biochim. Biophys. Acta Biomembr., 1418, 19 (1999).．電荷を指標とすることは，未知の構造を持つ抗原に対しても応答可能という利点があるものと予想される．このような，特定の構造ではなく電荷などの分子パターンを認識する分子はパターン認識受容体（PRR）と呼ばれ⁽¹⁹⁾19) S. Akira, S. Uematsu & O. Takeuchi: Cell, 124, 783 (2006).，PRRにより認識される外因性抗原に特有のパターンは病原体関連分子パターン（PAMPs），内因性抗原に特有のパターンはダメージ関連分子パターン（DAMPs）と呼ばれる．PRRによるPAMPs, DAMPsの認識には様々な機構が複合的に関わっていることが予想されるが，表面の負電荷は多くのPAMPs, DAMPsに共通して見られるパターンであり，パターン認識においても重要であることが予想される．

また興味深いことに，酸化型ビタミンC（デヒドロアスコルビン酸）やカテキン，ピセアタンノールなどの食品成分により修飾を受けたタンパク質は，抗AGEs自然抗体により認識されることが明らかになった^{(20, 21)}20) Y. Hatasa, M. Chikazawa, M. Furuhashi, F. Nakashima, T. Shibata, T. Kondo, M. Akagawa, H. Hamagami, H. Tanaka, H. Tachibana et al.: PLoS One, 11, e0153002 (2016).21) M. Furuhashi, Y. Hatasa, S. Kawamura, T. Shibata, M. Akagawa & K. Uchida: Biochemistry, 56, 4701 (2017).．これらは糖と同じように電荷を変化させたり，タンパク質同士を凝集させたりすることで抗原性を付与していることが予想され，生成した修飾タンパク質は内因性抗原と類似の構造や機能を有しているものと考えられる．また，DHAで修飾させたタンパク質をアジュバントと共にマウスに複数回腹腔投与すると，自然抗体産生に関わるB-1細胞の割合がアジュバントのみを投与した対照群と比較し有意に増加すること，自然抗体の産生が増加することが明らかとなり，食品に由来する修飾タンパク質が自然免疫系を活性化することが予想された．食品成分を摂取することで体内に吸収され，生体タンパク質と反応することで修飾タンパク質を生成し，それが免疫細胞を刺激するという経路が，通常の食生活でどの程度起こっているかについては不明であり，さらなる検証が必要ではあるが，このような経路が日常的な食生活で起こることは，適度な免疫系の活性化につながり，恒常性維持にも寄与している可能性がある．

内因性抗原と疾患の関わりとして，自己免疫疾患との関係が挙げられる．自己に由来する分子は本来，抗原として認識されないものであり，免疫系の異常として自己分子による免疫応答が起こる場合，自己免疫疾患などの疾患へとつながる．自然抗体は自己由来分子に反応するという意味では自己抗体の性質を持つものである．自然抗体はこれまでに述べたように生体にとって有益な分子であるが，獲得免疫系によって産生が誘導される自己抗体（主にIgG）は細胞傷害性を持つなど自然抗体とは異なり有害である．全身性エリテマトーデス（SLE）はDNAに対する自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患であり，その発症メカニズムは明らかでないが⁽²²⁾22) X. Wang & Y. Xia: Front. Immunol., 10, 1667 (2019).，酸化特異的エピトープの産生が自己免疫応答の誘導に関わることも示唆されている⁽²³⁾23) B. J. Ryan, A. Nissim & P. G. Winyard: Redox Biol., 2, 715 (2014).．筆者らはこれまでに，SLEモデルマウスであるMRL-lprマウス，MFG-E8 KOマウスでAGEsなど酸化タンパク質に対するIgM抗体が通常時より増加していることを確認している^{(16, 24)}16) M. Chikazawa, N. Otaki, T. Shibata, H. Miyashita, Y. Kawai, S. Maruyama, S. Toyokuni, Y. Kitaura, T. Matsuda & K. Uchida: J. Biol. Chem., 288, 13204 (2013).24) M. Chikazawa, N. Otaki, T. Shibata, Y. Kawai, T. Yasueda, T. Matsuda & K. Uchida: PLoS One, 8, e68468 (2013).．また，MFG-E8 KOマウスで産生される酸化タンパク質に対するIgM抗体はアポトーシス細胞の表面に結合し，死細胞による貪食を促進することについても確認した（図3図3■予想される自然抗体を介したアポトーシス細胞除去効果）．MFG-E8はマクロファージなどにより分泌される死細胞の貪食・除去を担う分子であり，MFG-E8を欠損したマウスはSLE様の自己免疫疾患を呈する^{(25, 26)}25) R. Hanayama, M. Tanaka, K. Miwa, A. Shinohara, A. Iwamatsu & S. Nagata: Nature, 417, 182 (2002).26) R. Hanayama, M. Tanaka, K. Miyasaka, K. Aozasa, M. Koike, Y. Uchiyama & S. Nagata: Science, 304, 1147 (2004).．このように，MFG-E8と同様の性質をもつ自然抗体が増加することで，MFG-E8の欠損で滞った死細胞処理が代替的な経路で行われ，アポトーシス細胞に対する自己免疫応答が抑制されているものと予想される．このように，自然抗体は自己に対する反応性を持つものの，疾患で増加する自己抗体とは異なり自己免疫応答抑制的な働きをするものであると考えられる．自然抗体の増加は内因性抗原の生体への蓄積を防ぐことで過剰な自己免疫応答の誘導を妨げ，恒常性維持に寄与することが予想される．

図3■予想される自然抗体を介したアポトーシス細胞除去効果

自然免疫系分子が有する新たな機能性の探索

免疫細胞は抗体以外にも様々な分子を産生・分泌しており，これらは異物の除去のみでなく様々な生体応答に寄与していると考えられる．筆者らはこれまでに，抗体以外の免疫系分子の新たな機能性を明らかにするべく検討を行ってきた．

組織のターンオーバーに伴い，体内では常にアポトーシスが起こっている．アポトーシス細胞は処理されず残存することで炎症誘導，自己免疫疾患発症などを引き起こすことから，速やかに除去される必要があり，その機能を担うのが自然免疫系である．前章で述べたMFG-E8のように，体内にはアポトーシス細胞の表面とマクロファージ細胞表面の受容体両方に結合し，二者の橋渡しをするような形でマクロファージによる死細胞の貪食を促進する分泌分子が複数存在する⁽²⁷⁾27) N. D. Barth, J. A. Marwick, M. Vendrell, A. G. Rossi & I. Dransfield: Front. Immunol., 8, 1708 (2017).．これに加えて死細胞がマクロファージの受容体に直接認識されるという経路もあり，複数の分子を介した経路が存在することでより効率的で速やかな除去が可能になっていると考えられる．

AGEsの除去に関しても，前述の通り複数のスカベンジャー受容体を介した経路が知られるが，自然抗体のようにAGEsを認識するような分泌分子が血液中にあることを予想し，その探索を行った．AGEsを結合させた磁気ビーズとヒト血清をインキュベート後，ビーズに結合したタンパク質を質量分析により解析したところ，AGEs結合タンパク質として補体C1qが明らかになった⁽²⁸⁾28) M. Chikazawa, T. Shibata, Y. Hatasa, S. Hirose, N. Otaki, F. Nakashima, M. Ito, S. Machida, S. Maruyama & K. Uchida: Biochemistry, 55, 435 (2016).．補体は自然免疫系分子であり，自然抗体と同様に血液中に存在し，抗原表面に結合することで初期防御に関与する．C1qは補体古典経路の開始因子であり，C1qが抗原に直接結合，あるいは抗体を介して間接的に結合することで経路が活性化され，補体分子が次々と抗原表面に結合することで貪食の促進や病原体などの破壊を誘導している⁽²⁹⁾29) S. S. Bohlson, S. D. O’Conner, H. J. Hulsebus, M.-M. Ho & D. A. Fraser: Front. Immunol., 5, 1 (2014).．

さらなる検討の結果，C1qはAGEsと直接的に相互作用しており，そこにはAGEsの表面電荷とC1q A鎖に存在する正電荷を豊富に含む領域が重要であることが明らかになった．このように，自然抗体だけでなく補体においても電荷を介したAGEsとの相互作用が起こることがわかる（図4図4■自然抗体，C1qの電荷を介したAGEs除去作用）．また，C1qが存在することでマクロファージによるAGEsの取り込みは有意に促進されることから，血液中のC1qは体内からのAGEsの速やかな除去において重要であり，AGEs蓄積予防に寄与していると考えられる．以上より，AGEsの除去には自然抗体，補体，スカベンジャー受容体などの様々なPRRが関与していることが予想される．

図4■自然抗体，C1qの電荷を介したAGEs除去作用

また，骨格筋における自然免疫系分子の役割についても検討を行った．骨格筋は複数の筋細胞が融合した多核の筋管細胞より構成される．筋肉の発生，運動時などの筋肥大，傷害を受けた筋組織の修復などの際には筋融合が起こるが，その際にはアポトーシス細胞が生じる⁽³⁰⁾30) M. H. Dehkordi, A. Tashakor, E. O’Connell & H. O. Fearnhead: Cell Death Dis., 11, 308 (2020).．過剰なアポトーシス細胞は免疫系によって除去されるべきものである一方⁽³¹⁾31) C. Sciorati, E. Rigamonti, A. A. Manfredi & P. Rovere-Querini: Cell Death Differ., 23, 927 (2016).，近年，骨格筋において発現する免疫系の受容体であるBAI1がアポトーシス細胞を認識することで，筋融合が促進されることが明らかになった⁽³²⁾32) A. E. Hochreiter-Hufford, C. S. Lee, J. M. Kinchen, J. D. Sokolowski, S. Arandjelovic, J. A. Call, A. L. Klibanov, Z. Yan, J. W. Mandell & K. S. Ravichandran: Nature, 497, 263 (2013).．これは，免疫細胞以外の細胞においても免疫系の受容体が機能していることを示している．ここから，骨格筋における免疫系分子の役割に着目した検討を行った．その結果，MFG-E8が骨格筋細胞から分泌されていることを確認した⁽³³⁾33) M. Chikazawa, M. Shimizu, Y. Yamauchi & R. Sato: Biochem. Biophys. Res. Commun., 522, 113 (2020).．また，MFG-E8の分泌量は未分化，分化後で変化はないものの，分化時に分泌されたMFG-E8は分化中の細胞表面に結合することが確認され，これは筋融合の促進にも寄与していることが示唆された．筋細胞はMFG-E8の受容体を発現していることから，アポトーシス細胞とマクロファージの融合と同様に，MFG-E8が筋細胞同士の接着を促し，筋融合を促進することが予想される．またアポトーシス細胞表面に結合することで，過剰な炎症や自己免疫応答を抑制していることも示唆された．このように，免疫系の分泌分子は筋組織の維持においても機能することが予想された（図5図5■骨格筋におけるMFG-E8の作用）．食品成分による骨格筋肥大効果や萎縮抑制効果は高齢化が進む現代において注目されるが，本成果は食を介して骨格筋のMFG-E8の分泌を活性化することで，高齢者のサルコペニア予防などにも寄与することができる可能性を示すものである．

図5■骨格筋におけるMFG-E8の作用

脂質酸化に由来する内因性抗原の解析

筆者らの研究室は，酸化修飾によって生成する「ピロールリジン」の自己免疫疾患や脂質異常症との関与やその生体での機能性について明らかにしてきた^{(34, 35)}34) H. Miyashita, M. Chikazawa, N. Otaki, Y. Hioki, Y. Shimozu, F. Nakashima, T. Shibata, Y. Hagihara, S. Maruyama, N. Matsumi et al.: Sci. Rep., 4, 5343 (2014).35) S. Hirose, Y. Hioki, H. Miyashita, N. Hirade, J. Yoshitake, T. Shibata, R. Kikuchi, T. Matsushita, M. Chikazawa, M. Itakura et al.: J. Biol. Chem., 294, 11035 (2019).．ピロールリジンは酸化脂質とタンパク質のリジン残基の反応により生成する酸化タンパク質の修飾構造の一つであり，核酸染色試薬や抗DNA自己抗体に認識されるというユニークな特性を有している．また，ピロールリジンはAGEsなどの酸化タンパク質と同様に負電荷を持つこと，導電性などDNAと類似した特性を有することから，抗DNA自己抗体の生成過程に関与している可能性も考えられるほか，脂質異常症の際に起こる自己免疫応答の誘導に関与している可能性も示唆されるなど⁽³⁶⁾36) S. Y. Lim, K. Yamaguchi, M. Itakura, M. Chikazawa, T. Matsuda & K. Uchida: J. Biol. Chem., 298, 101582 (2022).，生体内における機能についてはさらに詳細な検討が必要である．

これまでに，生体内でピロールリジンが存在することは質量分析による定量で明らかにされてり，またピロール化タンパク質に対する抗体も存在することが確認されている．しかし，生体内でどのような経路を介してピロールリジンが生成するのかについては不明であった．これを明らかにするべく検討を行った結果，酸化させた多価不飽和脂肪酸とタンパク質の反応によりピロールリジンが形成されること，特にエイコサペンタエン酸，ドコサヘキサエン酸など不飽和度の高い脂肪酸で生成量が多いことが確認された⁽³⁷⁾37) M. Chikazawa, J. Yoshitake, S. Y. Lim, S. Iwata, L. Negishi, T. Shibata & K. Uchida: J. Biol. Chem., 295, 7697 (2020).．不飽和脂肪酸が酸化を受けると炭化水素鎖は分解され，様々な反応性の高い低分子アルデヒドを生じることが報告される．DHA, EPAの酸化で生じるアルデヒドの中にピロール化因子が存在すると予想し，脂肪酸酸化物をHPLCで分画後，各画分をタンパク質とインキュベートして各画分のピロールリジンの生成を確認した．ピロールリジンの生成が確認された画分について，DNPHによりアルデヒドを誘導体化した後，質量分析により含まれるアルデヒドの同定を行ったところ，グリコールアルデヒドが確認された（図6図6■グリコールアルデヒドを介したタンパク質のピロール化）．グリコールアルデヒドは脂質のみでなく糖，アミノ酸，アスコルビン酸など様々な分子より産生するため，ピロール化は体内で多様な経路で起こると考えられ，生体の状態を反映するマーカー分子となることが予想される．また，ピロール化タンパク質は負電荷を有しており，自然抗体や多重交差性抗体により認識される．酸化タンパク質中には様々な修飾構造が生成していると考えられるが，ピロールリジンは生体内で生成する内因性抗原の一つであり，免疫系の活性化など生体内で様々な作用を及ぼすことが予想される．

図6■グリコールアルデヒドを介したタンパク質のピロール化

お わ り に

以上より，生体内で生じる様々な内因性抗原が自然免疫系分子と結合することを明らかにし，また結合には分子表面の電荷を介するなどある程度共通したメカニズムが存在することが示唆された．内因性抗原の蓄積は炎症の誘導や自己免疫応答などを引き起こすと考えられるが，今回紹介した生体に備わる自然免疫系分子が内因性抗原を除去することで，生体にとって不都合な応答が起こらないように保たれていることが予想される．また，自然免疫系による内因性抗原の認識は，骨格筋における筋細胞同士の融合など，組織における生体応答に関与することも確認された．自然免疫系は異物認識を介した感染の予防のみならず，内因性抗原や食品成分による制御を介して全身で様々な機能を担うことで，健康維持に寄与していることが予想される．今後は食品成分と免疫系の関わり，健康や疾病予防における作用についてさらに詳細に明らかにすることで，本分野の研究の発展へ貢献するとともに食を介した社会への貢献を目指したい．