酵母はビール製造における発酵工程で主要な役割を果たし，ビールの香味に最も大きな影響を与えている．安定した品質のビールを造るために，醸造技術者は長い経験に基づき発酵工程における管理を慎重に行っている．中でも，酵母の選択は最も重要であり，望ましい性質を持つ酵母を選抜し，それを常に最良の状態で安定に維持していくことは，醸造技術者にとって最大の関心事である．本稿では，従来からある解析技術に加えて，飛躍的に発展してきた遺伝子解析や成分分析技術を駆使して，下面ビール酵母の醸造特性を解析し，品質や工程の改善に繋げた．また，酵母による種々の香り成分の物質変換機構を解明し，香味改善や新商品開発にも展開した．

Key words: ビール; 酵母; 凝集性; オフフレーバー; バイオトランスフォーメーション

はじめに

微生物の凝集現象は100年以上も前から知られており，酵母においては1876年にパスツールによりビール酵母で最初に報告された現象である．現在，世界的に主流のビール醸造は，発酵で増殖した酵母が徐々に凝集・沈降することから下面発酵と呼ばれ，この酵母の凝集性を活用することでビールの大量生産が可能になったと言えるだろう．しかし，この下面ビール酵母は，様々な醸造特性が変化し易いことが課題になっていた．

サッポロビール社（以下，当社）では，研究所での小スケールの発酵試験や遺伝子解析・機器分析技術を駆使して，実際に工場で使用している実用酵母の醸造特性を調査した．その研究を進めるうち，元来Saccharomyces cerevisiaeとS. eubayanusの異種酵母のハイブリットである下面ビール酵母S. pastorianusの複雑な遺伝的背景に起因するゲノム構造の不安定性にいち早く気づき，醸造特性の中で重要でかつ変化し易いと言われていた凝集性が変化するメカニズムを遺伝子レベルで明らかにした．その知見は，高品質のビールを大量生産するために必要な凝集性をコントロールする技術として，安定的なビール生産に活用され，また，ビール会社にとって門外不出である実用酵母の集中管理と酒母の供給スキームも確立させてきた．

また，当社は1990年代以降，市場の要請に応える形で台頭した発泡酒，新ジャンルにおいて，それぞれ「麦芽25％未満の発泡酒」，「麦芽を全く使用しない新ジャンル」といった業界初のエポックメイキングな商品で市場構造を変革してきたが，そういった商品の製造においては，麦芽使用率が少ないか，麦芽を使用しない等，低栄養での発酵のため，通常のビール醸造の知見からは予期できなかったオフフレーバー（本来のにおいから逸脱した異臭）が生成するなど新たな課題もあった．そういった低栄養環境での香味改善にも継続的に取り組んできた．さらに，酵母による発酵過程での原料由来成分のポジティブな物質変換とその官能特性への影響を新たに見出だし，2020年代以降のビール回帰の流れや，コロナ禍を経て再確認されたお酒のコミュニケーション価値向上につながるような新商品開発にも展開した．本稿ではそれらの取り組みについて紹介・解説する．

下面ビール酵母の凝集性の制御

下面ビール酵母の凝集性は，重要な醸造特性の一つである．この酵母の凝集形質が上手く工程に利用されている（図1図1■下面ビール醸造工程における酵母の流れ）．ビール醸造は主発酵と後発酵からなり，大半の酵母は主発酵終了後に発酵タンクの底部から効率的に回収され，次の発酵に使用するという工程が数回繰り返される．このように，凝集性は下面ビール酵母の基本的でかつ重要な性質であるにもかかわらず，実際の醸造現場において，完全に制御されてはいなかった．

図1■下面ビール醸造工程における酵母の流れ

1. 下面ビール酵母における染色体DNAパターンの不安定性の発見

まず，染色体解析を行うことのできるパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いて実用酵母SBC0001（P）株とSBC0002（Q）株から得られた分離株を比較してみた．株間で変化した染色体DNAを同定するためにDNAプローブを用いたPFGEサザン解析を行った結果，染色体の欠失，分断，転座などのダイナミックな変化が起こっている可能性が示唆された⁽¹⁾1) Y. Takata, J. Watari, N. Nishikawa & K. Kamada: J. Am. Soc. Brew. Chem., 47, 109 (1989).．

一般に，下面ビール酵母の醸造特性は変化することが知られているが，染色体長の変化と醸造特性との関係を上手く説明できるまでには至らなかった．それは，下面ビール酵母S. pastorianusがS. cerevisiaeとS. eubayanusの自然交雑株であることや3～4倍体の高次倍数体であることなどの複雑な遺伝的背景によると考えられた．つまり，一つの遺伝子に何らかの変異が起こってもそれを補う遺伝子が他に存在するために，染色体の長さが変化するようなダイナミックな変異が起きてもそれが形質の変化まで及ぶことは少ないと考えられた．ところが，この研究の過程において，調査項目の一つとして挙げていた下面ビール酵母の凝集形質が変化し易いことが判ってきた⁽²⁾2) M. Sato, J. Watari, H. Sahara & S. Koshino: J. Am. Soc. Brew. Chem., 52, 148 (1994).．

2. S. cerevisiaeの凝集性遺伝子のクローニングと塩基配列の決定

当社では，下面ビール酵母の解析に先立ち，まず遺伝子レベルでの研究が進んでいたS. cerevisiaeの凝集性遺伝子の解析に取り組んだ．凝集性遺伝子FLO1は第I染色体上に存在し，ORFが4611 bpであり，その塩基配列から1537個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていると推測された⁽^3～6)3) J. Watari, Y. Takata, M. Ogawa, N. Nishikawa & M. Kamimura: Agric. Biol. Chem., 53, 901 (1989).4) J. Watari, Y. Takata, M. Ogawa, J. Murakami & S. Koshino: Agric. Biol. Chem., 55, 1547 (1991).5) J. Watari, M. Nomura, H. Sahara, S. Koshino & S. Keränen: J. Inst. Brew., 100, 73 (1994).6) J. Watari, Y. Takata, M. Ogawa, H. Sahara, S. Koshino, M.-L. Onnela, U. Airaksinen, R. Jaatinen, M. Penttilä & S. Keränen: Yeast, 10, 211 (1994).．一方，下面ビール酵母は，別名Lager酵母とも呼ばれることから，後に解析された下面ビール酵母の凝集性遺伝子は，Lg-FLO1遺伝子と命名された．

3. 下面ビール酵母の凝集性遺伝子の不安定性に関する研究

このように長年の疑問であった下面ビール酵母の凝集性について分子遺伝学的な解析が可能になり，凝集性の実体にかなり迫ることができるようになってきた．一方で，ビール醸造現場で比較的頻度高く起こる凝集性弱化現象のメカニズムはなお解決すべき課題であったことから，これについて調査したところ，この現象は，酵母細胞集団において，集団全体で起こる現象ではなく，一部の酵母細胞が非凝集性細胞に変化すること，つまり，凝集性株に対する非凝集性株の比率が増加することによって起こることを突き止めた．

その原因を調査する過程において，Lg-FLO1遺伝子のN末端部分と同様の塩基配列を有するがC末端部分が異なる新たな遺伝子を見出した．解析の結果，これはLg-FLO1遺伝子のN末端部位とS. cerevisiaeの第IX染色体に存在するYIL169cの融合遺伝子であり，S. cerevisiaeの第IX染色体に相当する染色体のYIL169cから左腕テロメアまでの約20kbの領域と，下面ビール酵母の第VIII染色体に相当する染色体のLg-FLO1遺伝子を含む領域の間で転座が起こっていると考えられた．

Lg-FLO1遺伝子のC末端領域は，GPIアンカータンパク質をコードしており，酵母細胞の表層にタンパク質を固定化する機能がある．あらたに生成したタンパク質は，C末端領域がYIL169cの一部と置き換わったため，細胞表層に局在できず，凝集に関与できなくなったと考えられる．このことから，本遺伝子をILF1（Inactivated Lg-FLO1）遺伝子と命名し，課題であった下面ビール酵母の凝集性弱化モデルを提案することができた（図2図2■Lg-FLO1遺伝子の不活性化モデル（☆はS.c.の第IX染色体とLgの第VIII染色体間の転座が起こったポイント））⁽^{7, 8)}7) M. Sato, J. Watari & K. Shinotsuka: J. Am. Soc. Brew. Chem., 59, 130 (2001).8) M. Sato, H. Maeba, J. Watari & M. Takashio: J. Biosci. Bioeng., 93, 395 (2002).．

図2■Lg-FLO1遺伝子の不活性化モデル（☆はS.c.の第IX染色体とLgの第VIII染色体間の転座が起こったポイント）

このように，下面ビール酵母の凝集性弱化現象のメカニズムを解明したことで，この知見を活用して，凝集性細胞比率を調整した株を作製し，ビール工場での実際の製造に供する等の対策がとれるようになった．ここまで説明してきた下面ビール酵母の遺伝的な不安定性に関する研究は，その後の研究所での実用酵母の集中管理と酒母の供給スキームの確立にもつながった．

酵母生理に着目した従来技術の改善・新技術の提案

凝集性の制御以外でも，酵母の生理や活用法（細胞融合や固定化酵母等も含む）に着目した様々な研究から，酵母の株間での特性を比較したり，発酵促進効果のある亜鉛含有酵母を活用したり，工場スケールの大型の発酵タンクに仕込からの麦汁を複数回に分けて導入する「掛け発酵」の条件を制御することで工程・香味改善を図るなど，従来技術の改善を継続的に行ってきた．

また，そのような知見の蓄積から，原料配合（≒栄養環境）がビールと異なる発泡酒や新ジャンルの開発，品質向上にも即応して，ビールテイスト飲料の市場構造を変革する端緒となった．

1. 酵母株に依存する好ましいエステルの生成能の解析

下面ビール酵母S. pastorianusの株間差はラガービールの品質に大きく影響する．下面ビール酵母の中でも特定の株で醸造したビールはエステル香の主要成分である酸酸イソアミルを他の製品の2倍程度含んでいるものもある⁽⁹⁾9) K. Tokita, K. Takazumi, T. Oshima & T. Shigyo: J. Am. Soc. Brew. Chem., 72, 154 (2014).．

そこで，酵母株間の遺伝子発現挙動をDNAマイクロアレイで比較したところ，BAP2遺伝子とBAT2遺伝子の発現量が高かった．BAP2遺伝子はロイシン，イソロイシン，バリン（分岐鎖アミノ酸，BCAA）の取り込みに関与するBCAAパーミアーゼをコードし，BAT2遺伝子はBCAA異化に関与するBCAAトランスアミナーゼをコードしている．この研究から，酢酸イソアミルの前駆体であるロイシンの細胞内への取り込み能力の高い株は，酢酸イソアミル前駆体を合成する能力が高いことにより，酢酸イソアミル生成能が高くなると考察された⁽¹⁰⁾10) K. Asada, K. Takazumi, M. Sato, T. Oshima & T. Shigyo: Am. Soc. Brew. Chem. Annual Meeting, (2014).．こういった知見は香味とエビデンスに基づく酵母株の使い分け等に活用できるものである．

2. 低栄養の発酵条件下でのオフフレーバーの生成機構

ビールに限らず，酒類への酵母の最大の寄与はアルコール発酵によるエタノールの生成であるが，その発酵の副生物として，さまざまな呈味成分や香気成分が生成される．その中には必ずしも好ましくないオフフレーバーもある．

1990年代以降，日本特有の市場条件（酒税法）によりビールテイスト飲料の分野では「発泡酒」，「新ジャンル（第三のビール）」と呼ばれる新しいカテゴリーが生み出され，市場を牽引してきた．当社はその市場において，「麦芽25％未満」の「発泡酒」や，麦芽を全く使用しない「その他の雑酒」（酒税法改正で後に「その他の醸造酒」，2024年現在は「発泡酒」に分類）を業界で初めて商品化し，市場構造を変革してきた⁽^{11, 12)}11) 潮井　徹：日本生物工学会誌，90, 235（2012）．12) 谷川篤史：日本生物工学会誌，90, 242（2012）．．

しかし，そういった麦芽使用率の少ない／麦芽を使用しない商品の製造においては，低栄養での発酵のため，通常のビール醸造の知見からは予期できなかったオフフレーバーが生成するなど新たな課題もあった．特に下面ビール酵母を使用した場合，硫化水素（H₂S）が高くなる傾向が見られ，これは業界共通の課題でもあった．当社では，当時，先端技術であったDNA shot-gun genome microarrayなどを活用し，その原因が遺伝子レベルではメチオニン合成経路中のS. cerevisiae型，S. eubayanus型遺伝子のmRNAの発現の違いであること（図3図3■ゲノム解析によるメチオニン合成経路と硫化水素生成機構の解明），発酵中のpHの違いでもH₂Sの生成量が変化すること等を解明した⁽^11～13)11) 潮井　徹：日本生物工学会誌，90, 235（2012）．12) 谷川篤史：日本生物工学会誌，90, 242（2012）．13) N. Kobayashi, M. Sato, S. Fukuhara, S. Yokoi, T. Kurihara, J. Watari, T. Yokoi, M. Ohta, Y. Kaku & T. Saito: J. Am. Soc. Brew. Chem., 65, 92 (2007).．

図3■ゲノム解析によるメチオニン合成経路と硫化水素生成機構の解明

さらに研究を進める中，アミノ酸以外のビタミン，ミネラルが不足すると，インドールのような通常ビールテイストでは見られないオフフレーバーが発生することも明らかにした⁽¹²⁾12) 谷川篤史：日本生物工学会誌，90, 242（2012）．．このように，麦芽に含まれるアミノ酸やビタミンのような微量栄養成分が不足すると，深刻な発酵性の低下や意外なオフフレーバー発生の懸念があることが判明し，この知見は，製造現場での工程管理の見直しや，香味品質の高い新商品開発につながった．

酵母による香気成分の物質変換と商品開発への応用

2000年代になると世界的にクラフトビールが隆盛し，それを牽引するインディアペールエール（IPA）スタイルのビールには，香気成分としてテルペン類やチオール類を多く含み，品種ごとに香りに特徴のあるホップが用いられている．当社では，そういったホップに由来する香気成分が，醸造中に酵母の作用によって変換されること，また，ホップの品種，その組み合わせによって特徴的な香りが形作られることを解明し，そのデータの活用が多様な商品群の開発・上市につながった⁽^14～16)14) 蛸井　潔：化学と生物，56, 508（2018）．15) 蛸井　潔，糸賀　裕，岡田行夫，鯉江弘一朗：化学と生物，57, 10 （2019）．16) 望月佐和子，蛸井　潔：化学と生物，57, 194（2019）．．これは2018年の農芸化学技術賞の対象となったホップに関する当社の取り組みの一部でもあったが，その後も発酵中に生成する分岐鎖脂肪酸のエチルエステルについて，従来の定説とは異なる生成経路（図4図4■ホップ由来の分岐差脂肪酸エチルエステル類の変換経路の提唱）を提唱するなど，取り組みを続けてきた⁽^{17, 18)}17) K. Takoi, Y. Itoga, K. Koie, J. Takayanagi, T. Kaneko, T. Watanabe, I. Matsumoto & M. Nomura: BrewingScience, 71, 100 (2018).18) K. Takoi: BrewingScience, 72, 196 (2019).．

図4■ホップ由来の分岐差脂肪酸エチルエステル類の変換経路の提唱

2017年の酒税法改正により，ホップ以外にもスパイスやハーブ，果汁等がビールの原料として認められた．しかし，スパイス，ハーブ類にはホップに含まれていない素材特有の香気成分が含まれるものもある．そういった香気成分の中にも，酵母の作用により変換されているものがあることが近年の研究・開発の過程でわかってきた．

一例として，レモン香の主成分であるシトラールは立体異性体のゲラニアールとネラールのほぼ等量の混合物を指す．レモン果汁，果皮などにも含まれるが，ハーブではレモングラスはシトラールを豊富に含む．ビールの発酵中にシトラールが存在すると，アルデヒドのゲラニアールとネラールがアルコール体のゲラニオール，ネロールに還元されることが分かった（図5図5■スパイス・ハーブ由来のシトラールの発酵での変換経路の提唱）．ひとたびゲラニオール，ネロールに反応が進めば，そのあとはホップで解明された経路に従って変換が進むことになるが，ホップを使った場合には実現できないレベルのゲラニオール，ネロール，β-シトロネロール含量・組成の柑橘感の強いビールを造ることができる⁽¹⁹⁾19) C. Osawa, A. Tanigawa, K. Takoi, T. Iimure & F. Ishida: European Brewery Convention 38th Congress, (2022).．

図5■スパイス・ハーブ由来のシトラールの発酵での変換経路の提唱

他にも，代表的なハーブであるミントに含まれるメントールを発酵させると酢酸メンチルが生成し，これは甘い香りを持つとともに，メントールの冷涼感に対するエンハンス効果もあることも見出している⁽¹⁹⁾19) C. Osawa, A. Tanigawa, K. Takoi, T. Iimure & F. Ishida: European Brewery Convention 38th Congress, (2022).．また，果汁やハーブのうち，アントシアニンを含む原料を使用するとビールのオフフレーバーであるダイアセチルが増加すること，この現象が特定の遺伝子の発現に起因していることも解明した⁽^{20, 21)}20) 谷川篤史，斎藤浩二，朝田　圭，高瀬貴仁，實方綾子，中山康行：平成28年度日本醸造学会大会，2016.21) 朝田　圭，實方綾子，谷川篤史，高瀬貴仁，豊嶋孝一：平成28年度日本醸造学会大会，2016.．スパイス，ハーブには従来のビール研究でターゲットとしてこなかったさまざまな成分が含まれるため，今後の展開も期待できる研究・開発テーマである．

おわりに

ビールは発酵が酵母による現象であることがわかる以前から長く飲み継がれてきたアルコール飲料の一つであり，また，酵母や酵素に関する初期の研究はビール酵母を実験材料としてスタートしたものも多い．下面ビール酵母の凝集性現象のように，そんな長い歴史の中でも，解明されていなかったことがいくつもあり，また，発泡酒や新ジャンルのように，長い歴史の中で行われていなかったことにトライしたことで，それまでになかった現象がみられるようなこともあった．酵母の研究，酵母を活用した開発はまことに奥が深く，たかが酵母，されど酵母である．

2000年代以降のクラフトブームでは先に紹介したようなスパイス，ハーブを活用したビールスタイルだけでなく，香味特性の異なる酵母の使い分け，複数の酵母を用いた発酵，乳酸菌などの他の微生物との複合発酵など，さまざまなチャレンジが行われており，酵母に関する研究の種が尽きることはないと思われる．これからも研究で未知の現象を解明し，開発や現場実装に活用していきたい．