【アニサキスの採取】

屋久島海域に生息するカツオにアニサキスが多く寄生していることから，屋久島海域で捕獲されたカツオを入手し，新鮮なうちに捌くことで内臓よりアニサキスの採取を行った．

図1■カツオ内臓からアニサキスを採取する様子

図2■採取したアニサキス

【タイハーブより成分の抽出および調整】

タイ料理に多用され，日本国内で入手可能な以下の10種類のタイハーブを用意した．

①タマリンドTamarindus indica　②パンダンリーフPandanus amaryllifolius　③ライムCitrus aurantiifolia　④青パパイヤCarica papaya L.　⑤レモングラスCymbopogon citratus　⑥コブミカンCitrus hystrix　⑦ナンキョウAlpinia galanga　⑧赤分葱Allium ascalonicum　⑨生胡椒Piper nigrum　⑩パクチーCoriandrum sativum

不純物を取り除くために十分に水洗いを行ったのち，各200 gを細かく粉砕した．葉，茎，皮，果肉，種を有するものについては全ての部位を採取し均一になるように混合した．各粉砕物にメタノール250 mLを加えて室温で24時間静置し，メタノール抽出液とした．

【殺アニサキス物質を有するハーブの特定】

アニサキス5個体と各メタノール抽出液5.0 mLを6穴マルチディッシュに分注した．15°Cで24時間保温した後，各アニサキスの固体を0.4％トリパンブルー染色液に5分間浸透させた．さらに，生理食塩水で軽く洗浄したのち，顕微鏡を用いて各細胞の染色の様子を観察しアニサキスの生死判定を行った．また，対照として生理食塩水およびメタノールのみにおけるアニサキスの生存状態について同様に観察し，これら溶媒の影響はないことを確認した．生死判定においてはトリパンブルー染色液が死細胞を青く染める特性を用い，全体が青く染まったものを死滅（＝効果あり）とし，染色が確認されなかったものについては生存（＝効果なし）とした⁽⁵⁾5）三重正和，小畠英理：Electrochemistry, 76, 924 (2008).．本実験を5反復行い，アニサキスの生存の評価を行った（n＝25）．

図3■染色が確認されなかったアニサキス（生存）

図4■染色が確認されたアニサキス（死滅）

その結果，パンダンリーフPandanus amaryllifoliusの抽出液においてのみ，アニサキス25個体に対する死滅効果が確認された．パンダンリーフは主に熱帯アジア地域やアフリカで栽培されている緑色の薬用植物であり，一般的には緑色の着色料に利用されるほか，芳香剤や蚊やゴキブリの忌避剤など多用途で用いられている⁽⁶⁾6) K. V. Wakte, A. B. Nadaf, R. J. Thengane & N. Jawali: Genet. Resour. Crop Evol., 56, 735 (2009).．

【パンダンリーフの有効成分の分離精製と特定】

クロマト管（φ25 mm, l＝350 mm）にシリカゲルを25 cm充填し，減圧濃縮したパンダンリーフ抽出液を，ヘキサン：酢酸エチル＝1 : 1混合溶媒を溶出溶媒に用い，11 mLずつ計50本のフラクションに分画した．3と同様に，各フラクションにアニサキス6個体を入れ，15°Cで96時間保温し，トリパンブルー染色液にて生死判定を行った．コントロール群として溶出溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝1 : 1）のみでも同様に実施した．その結果，フラクションNo.10, 11, 17において6個体すべての死滅が確認された．従って，アニサキス死滅効果のある成分本体はこれらのフラクションに含まれていると判断した．

続いて，上記3フラクションの溶液を減圧濃縮し，展開溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝2 : 1）を用いて，薄層クロマトグラフィーにて成分を分離した．フラクションNo.10から2つのスポット（Rf値0.48, 0.40），No.11から2つのスポット（Rf値0.35, 0.28），No.17から4つのスポット（Rf値0.43, 0.37, 0.26, 0.17）が得られた．同様の操作を複数回繰り返し，各スポットを回収したのちに，10 mgを生理食塩水に溶解した．そこにアニサキス6個体を入れ，15°Cで96時間保温し，トリパンブルー染色液にて生死判定を行った．その結果，フラクションNo.10のRf値0.48のスポットにおいて6個体すべての死滅が確認された．残りのスポットは，いずれも1～3個体の死滅しか確認できなかった．

【有効成分の構造解析】

TLCにて分離精製したスポットについて，フラクションNo.11のRf値048のスポットに有効成分が含まれていることが示唆されたため，分取用TLCを用いて該当スポットをかきとり，1.0 mgを東京海洋大学食品栄養化学研究室にて，NMR（Bruker社Avance 600 MHz）による構造解析を行った．分析試料については，凍結乾燥後，重クロロホルムを加えて震盪後に，上清を得て画分Aとした．さらに残渣に重メタノールを加えて震盪後に上清を得て画分Bとした．

画分Bについては，クロロフィルaのスペクトルと特徴が一致したことからクロロフィル類の混合物であると推定された．画分Aについて芳香環由来化合物，酸素官能基由来化合物，炭化水素由来化合物の数種類の化合物の存在が示唆された．サンプル量が少ないため，混合物の状態で二次元NMR解析を行った．

二次元NMRから推定される部分構造をもとに活性本体の構造を推定した．図5図5■画分Aの¹H NMRスペクトル（CDCl₃）の画分Aの¹H NMRのスペクトルをみると，0.5～1.5 ppmの炭化水素鎖由来の，3.0～4.1 ppmに酸素等の電子吸引性が高い元素に隣接すると考えられる水素の存在が示唆された．スペクトルが複雑であるため数種類の化合物が含まれると推定された．図7図7■二次元NMR　HMQC分析のHMQC分析，図8図8■二次元NMR　HMBC分析のHMBC分析により，代表シグナルの積分値よりある程度の存在比を示した以下の5種類の部分構造が存在すると推測した．従って，活性画分には少なくとも二種類の脂肪酸エステルが含まれている可能性が高いことが推定される．

図5■画分Aの¹H NMRスペクトル（CDCl₃）

図6■画分Bの¹H NMRスペクトル（MeOD）

図7■二次元NMR　HMQC分析

図8■二次元NMR　HMBC分析

図9■活性本体化合物が有すると考えられる部分構造