Wntシグナルとは

Wntシグナルは線虫からヒトに至るまで生物種を超えて高度に保存されたシグナル伝達経路で，初期発生における体軸形成から各種組織・器官の形態形成，出生後の細胞の増殖・分化・運動，組織幹細胞の維持，発がんなどのさまざまな生命現象において多彩かつ重要な役割を果たしている．

Wntという名前はその発見過程に由来する．ショウジョウバエの翅の形態形成において重要な役割を果たすwingless（wg）遺伝子とマウス乳がんで見いだされた発がん遺伝子int-1との相同性が高いことから両者を組み合わせWntと呼ばれるようになった．Wntは分子量約40 kDaの分泌性糖タンパク質であり，哺乳類においては現在までに19種のWntファミリーが知られている．本シグナル伝達経路には，1）β-catenin/TCF（T-cell factor）を介して標的遺伝子の発現を調節するWnt/β-catenin経路，2）細胞骨格系の制御に関与する細胞内平面極性（PCP）経路，3）細胞の接着，運動に関与しているとされるWnt/Ca²⁺経路の3つが知られている．β-catenin/TCF経路は古典的経路とも呼ばれβ-cateninに依存するが，ほかの2つはβ-cateninに依存しない．このβ-cateninはcadherin結合タンパク質として同定され，細胞接着において重要な役割を担っているが，同時に，β-catenin/TCF経路においてはメディエーターとして機能し，Wntシグナルの標的遺伝子の転写活性化を調節する．本稿ではβ-catenin/TCFに着目している．Wntリガンドがない状態すなわちWntシグナルがOFFの状態では，β-cateninは細胞質内においてcasein kinase-1α（CK1α），glycogen synthase kinase 3β（GSK3β），adenomatous polyposis coil（APC），Axinなどと複合体（β-catenin分解複合体）を形成し，2つのキナーゼCK1α，GSK3βによるリン酸化を受け，プロテアソーム系において分解される．一方，Wntタンパク質が存在する，すなわちWntシグナルがONの状態では，Wntがfrizzled（Fz）やlipoprotein-related protein 5/6（LRP5/6）に結合することでWntシグナルが活性化し，dishevelled（Dvl）によりGSK3βが阻害される．これによりβ-cateninのリン酸化，プロテアソーム系による分解が抑制され，細胞内にβ-cateninが蓄積される．蓄積したβ-cateninはその後，核内へ移行しTCFと複合体を形成し，標的遺伝子であるc-Myc，cyclin D1，COX-2などの転写が亢進される^(1,2)1) J. N. Anastas & R. T. Moon: Nat. Rev. Cancer, 13, 11 (2013).2) 菊池　章：生化學，81, 780 (2009).（図1図1■Wntシグナル経路）．

図1■Wntシグナル経路

本シグナルは前述のように初期発生や組織・器官形成などの重要な生命現象にかかわっているが，一方で，大腸がんをはじめとするさまざまながんにおいて異常亢進していることが知られているほか，糖尿病や精神疾患など各種疾患とのかかわりも示唆されている．このような背景からWntシグナルを調節することができる化合物は各種生命現象を研究するうえでの分子ツールや，医薬品リード化合物となることが期待される．

Wntシグナルを標的とした創薬研究

前述のように本シグナル経路はさまざまな生命現象，各種疾患への関与が知られている．大腸がん，胃がん，肝がんなどにおいてWnt/β-catenin経路を構成するリガンドや受容体，細胞内タンパク質，核内タンパク質の遺伝子変異や発現異常が認められている．特に大腸がんの約80%の症例においてAPCの遺伝子異常が知られている．APCは家族性大腸腺腫症の原因遺伝子として同定されたもので，遺伝子異常により変異したAPCはβ-cateninと結合することはできるもののAxinとの結合部位を欠失しているため，効率的なβ-cateninのリン酸化と，それに続くプロテアソームでの分解が起こらないため，β-cateninが蓄積し，Wntシグナルが更新するものと考えられる．そのほかにもβ-catenin，Axinなどの遺伝子変異などが知られている^(1,2)1) J. N. Anastas & R. T. Moon: Nat. Rev. Cancer, 13, 11 (2013).2) 菊池　章：生化學，81, 780 (2009).．

Wntシグナルのがん疾患における本シグナルの異常亢進が知られていることから，本経路を標的とした化合物の探索研究は医薬品の開発の観点からも熾烈な競争にある⁽³⁾3) H. Clevers & R. Nusse: Cell, 149, 1192 (2012).．現在エーザイ／PRISM Pharma社によるPRI-724の白血病に対する臨床試験が行われている⁽⁴⁾4) 小田上剛直，小路弘行：MEDCHEM NEWS, 22(1), 21 (2012).．PRI-742はWntシグナルの標的遺伝子の発現に重要なCBP（CREB binding protein）/β-カテニン複合体の形成を選択的に阻害する低分子化合物である．同様の作用を示すWnt阻害剤としては，ほかにICG-001などがある．Windorphenは，Wntシグナルの標的遺伝子の発現に重要なp300/β-catenin複合体の形成を阻害するとともに，p300のもつヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害する⁽⁵⁾5) J. Hao, A. Ao, L. Zhou, C. K. Murphy, A. Y. Frist, J. J. Keel, C. A. Thorne, K. Kim, E. Lee & C. C. Hong: Cell Reports, 4, 898 (2013).．XAV939はAxinの活性化により，IWP-2はWntリガンドの産生に必須なporcupineを阻害することでWntシグナルを阻害する⁽³⁾3) H. Clevers & R. Nusse: Cell, 149, 1192 (2012).．一方，Wntシグナルを活性化する化合物としてGSK3βの阻害剤である6-bromoindirubin-3′-oxime（BIO）⁽⁵⁾5) J. Hao, A. Ao, L. Zhou, C. K. Murphy, A. Y. Frist, J. J. Keel, C. A. Thorne, K. Kim, E. Lee & C. C. Hong: Cell Reports, 4, 898 (2013).や，β-cateninとAxinの複合体形成を抑制するSKL2001⁽⁶⁾6) J. Gwak, S. G. Hwang, H. S. Park, S. R. Choi, S. H. Park, H. Kim, N. C. Ha, S. J. Bae, J. K. Han, D. E. Kim et al.: Cell Res., 22, 237 (2012).，Wnt/β-catenin経路の活性化に必須であるAxin-LRP6相互作用を促進するヒガンバナアルカロイドlycorine誘導体であるHLY78⁽⁷⁾7) S. Wang, J. Yin, D. Chen, F. Nie, X. Song, C. Fei, H. Miao, C. Jing, W. Ma, L. Wang et al.: Nat. Chem. Biol., 9, 579 (2013).などが報告されている（図2図2■これまでに報告されているWntシグナルに作用する化合物の一例）．そこでわれわれはWntシグナルに着目し，天然由来のWntシグナルを調節する化合物の探索研究を行った．

図2■これまでに報告されているWntシグナルに作用する化合物の一例

Wntシグナルを標的としたスクリーニング

当研究室で独自に構築した天然資源抽出物ライブラリーのうち，バングラデシュおよびタイにて採取した植物エキス，千葉県を中心に日本各地で採取した土壌，海水，海砂などから当研究室にて分離培養した放線菌を対象としてWntシグナルを標的としたスクリーニングを行った．スクリーニング試験は，培養細胞を用いたTOP-Flash/FOP-Flashルシフェラーゼアッセイシステム⁽⁸⁾8) X. Li, T. Ohtsuki, T. Koyano, T. Kowithayakorn & M. Ishibashi: Chem. Asian J., 4, 540 (2009).を用いて評価した．本アッセイシステムは，ヒト胎児腎細胞HEK293に野生型TCF結合領域（CCTTTGATC）をもつSuperTOP-Flashレポーター遺伝子を安定導入したSTF/293細胞を用い，試料添加によるルシフェラーゼ活性（TOP活性）の変化を測定することによりWntシグナルの最下流に位置するTCF/β-catenin転写活性の評価が可能である．なおSTF/293細胞をそのまま試験に用いると内在性β-catenin量が低いため，TOP活性が小さい．そのため，試料とともにGSK3β阻害剤であるLiClを添加することにより，β-cateninの分解を抑制し，TOP活性を刺激して試験を行った．また，細胞生存率も併せて評価しており，細胞数の減少によりルシフェラーゼ活性が低下する可能性を除外した．

良好な活性を示した化合物については疑陽性を除く目的で，変異型TCF結合領域（CCTTTGGCC）をもつSuperFOP-Flashを導入した細胞を用いたルシフェラーゼ活性（FOP活性）を併せて試験した．陽性試料は，FOP活性に影響することなくTOP活性のみを選択的に減少させると考えられるが，試料が偽陽性であった場合，ルシフェラーゼタンパク質の発現や分解などに関与すると考えられ，TOP活性とともにFOP活性も低下すると考えられる．したがってTOP活性のみを減少させ，FOP活性および細胞生存率を変化させないものがTCF/β-catenin転写阻害活性（Wntシグナル阻害活性）をもつと判断できる（図3図3■TOP-Flash/FOP-Flashルシフェラーゼアッセイシステム）．

図3■TOP-Flash/FOP-Flashルシフェラーゼアッセイシステム

われわれは，TOP活性を指標としたスクリーニングにおいて阻害活性が認められた数種の植物および放線菌抽出物を見いだした．次にこれらの抽出物から得た活性成分とそれらのWntシグナル阻害活性について概説する．

Calotropis giganteaから得られたWntシグナル阻害成分⁽⁹⁾9) H. Y. Park, K. Toume, M. A. Arai, S. K. Sadhu, F. Ahmed & M. Ishibashi: ChemBioChem, 15, 872 (2014).

バングラデシュ産にて採取したCalotropis gigantea（和名：カイガンタバコ）滲出液メタノールエキスは，スクリーニング試験において5 µg/mLの濃度で細胞生存率を顕著に低下させることなく，TOP活性をほぼゼロに低下させた．通常エキスの段階では，このような低濃度で活性を示すことはあまりなく，強力な活性化合物の存在が期待された．本植物はガガイモ科（Asclepiadaceae）に属する常緑低木でアジア，アフリカに広く分布し，幹などに傷をつけると白い乳液を出す．本研究ではこの乳液（滲出液）を用いた．そのメタノールエキスを溶媒分配し，活性が認められた酢酸エチル可溶部について活性試験を指標として，シリカゲル，ODSカラムによる分画を進めた．6種のカルデノライド類（1～6）を単離し，核磁気共鳴（NMR）および質量分析（MS）スペクトルデータの解析および文献値との比較によりこれらの化学構造を決定した（図4図4■Calotropis giganteaより単離した化合物）．これらは10位にアルデヒド基をもつ共通する骨格をもつが，左側の3′位の置換基が異なっていた．

図4■Calotropis giganteaより単離した化合物

これら化合物のTCF/β-catenin転写阻害活性を評価したところ，1～6はnMオーダーでTOP活性を阻害し，そのIC₅₀値は0.7～3.8 nMであった（図5図5■化合物1-6のTCF/β-catenin転写阻害活性）．これら化合物はFOP活性を顕著に低下させることはなかった．1, 3, 5, 6は著しく細胞生存率を低下させることなく，TOP活性のみを低下させていたことから，TCF/β-catenin転写阻害活性を有していると判明した．一方，2と4はTOP活性のIC₅₀値に近い濃度においてアッセイ細胞であるSTF/293細胞の細胞生存率を低下させており，TOP活性の減少は，細胞数の減少に起因すると推定された．

図5■化合物1-6のTCF/β-catenin転写阻害活性

次にWntシグナルの亢進が知られており，細胞増殖がWntシグナルに依存している3種の大腸がん細胞の細胞生存率に対する1～6の影響を調べた．ここでは，APCの欠失変異体であるSW480およびDLD1細胞とβ-cateninに変異をもつHCT116細胞を用い，比較対象としてWntシグナル非依存性の大腸がんRKO細胞を用いた．Wntシグナルを阻害する化合物はWnt非依存性細胞には影響することなく，Wnt依存性細胞の細胞生存率を選択的に低下させると考えられる．

これら化合物のうち，5種の化合物（1, 3～6）は，1～10 nMの濃度範囲においてはRKO細胞の細胞生存率を低下させることなく，Wnt依存性大腸がんSW480，DLD1，HCT116細胞の細胞生存率を低下させた（IC₅₀値：1.8～7.0 nM，表1表1■化合物1～6の大腸がん細胞に対する細胞毒性）．この結果から，1, 3, 5, 6はWntシグナルを阻害することにより，Wntシグナル依存性細胞に対して細胞生存率を低下させると示唆された．

このうちcalotropin（1）について，そのWntシグナル阻害作用のメカニズムを解明する目的でWntシグナル関連タンパク質への影響を検討した．まず，Wntシグナル調節において重要な役割を担う転写活性化因子β-cateninレベルへの影響をウェスタンブロットにより調べた．その結果，SW480細胞において1は濃度依存的にβ-cateninを減少させており，核内および細胞質においてもβ-cateninを減少させていた（図6A図6■calotropin（1）はプロテアソーム系を介してβ-cateninを分解する）．β-Cateninは，前述のように細胞質内で，CK1α，GSK3βによりリン酸化を受け，プロテアソーム系により分解される．一方，分解を免れたβ-cateninは核内へ移行し，TCFなどと複合体を形成し，Wntシグナルの標的遺伝子の転写を亢進する．もし，TCF/β-catenin転写阻害活性を示す化合物が核内のβ-cateninのみを減少させた場合，A）β-cateninの核内蓄積の抑制がWntシグナル阻害（TCF/β-catenin転写阻害）の作用機序と考えられる．一方，細胞質および核のβ-cateninを減少させない場合は，B）核内におけるTCFなどとの複合体形成もしくは標的遺伝子のプロモーター領域において転写調節領域との結合の阻害が主な作用機序と考えられる．しかしcalotropin（1）は，核内および細胞質においてもβ-cateninを減少させていたことから，A），B）の機構ではなく，C）細胞質内においてβ-cateninを減少させ，その結果，核内へ移行するβ-cateninが減少しWntシグナル（TCF/β-catenin転写）が阻害されるものと考えられた．1のWntシグナルの阻害は，本シグナルの標的遺伝子であるc-mycタンパク質の発現が，1の濃度依存的に低下していたことからも支持された．