高速原子間力顕微鏡（高速AFM）

原子間力顕微鏡（atomic force microscopy; AFM）は，1986年に発明された走査型プローブ顕微鏡の一種である⁽⁵⁾5) G. Binnig, C. F. Quate & C. Gerber: Phys. Rev. Lett., 56, 930 (1986).．AFMでは，基板上に固定した試料の表面を，柔らかい素材でつくられたカンチレバーの先端に付いたシャープな探針でなぞることにより，試料表面の凹凸情報を計測し，試料表面の三次元情報をナノメートルオーダーの空間分解能で取得することができる（図1図1■高速AFM装置）．AFMが生体試料の観察に適している理由を2つ挙げる．一つ目の理由は，生体分子を生理的環境下で観察できることである．AFMは，幅広い観察環境（空気中，液中，真空中など）に対応することが可能である．したがって，AFMは緩衝液中や培養液中などの生体分子が実際に機能できる生理的環境においてタンパク質，核酸，細胞などの構造をイメージングできる．もう一つの理由は，染色などの試料にダメージを与える可能性のある操作を行うことなく生体試料を観察できることである．生体分子は，主として炭素，酸素，窒素，水素などの軽元素により構成されているため電子密度が低い．そのため，電子顕微鏡を用いて観察を行う際には，十分なコントラストを得るために重金属溶液を用いてネガティブ染色を施すなどの処理操作が必要である．一方，原子間力を検出するAFMでは，一切の染色操作なしで高いシグナルノイズ比をもつ像を取得することができる．このようにAFMはネイティブな状態の生体分子の構造を高い分解能で観察できる優れた特性を有する．しかしながら，通常のAFMでは画像の取得に分単位の時間がかかり，生理的な条件下で生体分子の連続的な構造変化を動的に捉えることは困難であった．金沢大学理工研究域バイオAFM先端研究センターの安藤敏夫教授の研究グループでは，AFMの高速化技術の開発に取り組み，およそ20年間にわたる開発研究によりタンパク質などの柔らかい生体分子を壊すことなく，なおかつ分子の構造動態変化を捉えられるほど高速にイメージングできる高速AFMの開発に成功した．2008年には実用レベルの高速AFMが完成している⁽⁶⁾6) T. Ando, T. Uchihashi & T. Fukuma: Prog. Surf. Sci., 83, 337 (2008).．高速AFMは，最高でXY方向1〜2 nm，Z方向で0.1 nmの空間分解能と30ミリ秒の時間分解能を有し，溶液中にあるタンパク質分子を動画観察することができる．高速AFMの原理や装置については文献6を，操作方法については文献7，日本語の総説については文献8を参照いただきたい^(6～8)6) T. Ando, T. Uchihashi & T. Fukuma: Prog. Surf. Sci., 83, 337 (2008).7) T. Uchihashi, N. Kodera & T. Ando: Nat. Protoc., 7, 1193 (2012).8) 安藤敏夫：“1分子生物学”，原田慶恵，石渡信一編，化学同人，2014, p. 239.．現在，この革新的な顕微鏡を用いて，さまざまなタンパク質の構造変化が解析され，報告されている．たとえば，アクチン繊維の上でのミオシンV分子の歩行運動⁽⁹⁾9) N. Kodera, D. Yamamoto, R. Ishikawa & T. Ando: Nature, 468, 72 (2010).，F₁-ATPaseサブユニットの回転的な構造変化⁽¹⁰⁾10) T. Uchihashi, R. Iino, T. Ando & H. Noji: Science, 333, 755 (2011).，セルロース分解酵素がセルロース繊維の上を運動しながらセルロースを分解する様子⁽¹¹⁾11) K. Igarashi, T. Uchihashi, A. Koivula, M. Wada, S. Kimura, T. Okamoto, M. Penttila, T. Ando & M. Samejima: Science, 333, 1279 (2011). などの動態観察の結果が続々と報告されている^(12,13)12) T. Ando, T. Uchihashi & N. Kodera: Annu. Rev. Biophys., 42, 393 (2013).13) T. Ando: Curr. Opin. Struct. Biol., 28, 63 (2014).．このように高速AFMは，生理的環境中での生体分子1分子の動態を捉えることで，分子の機能メカニズムを理解するための有用なツールとなっている．

図1■高速AFM装置

（A）高速AFM装置の模式図．（B）カンチレバーの走査型電子顕微鏡写真．カンチレバーの先に，炭素でできた探針が付いている．

AFMによるバクテリア細胞観察

今世紀に入り，微生物学の分野においても，AFMを観察手法として用いた研究が報告されるようになった．空気中や液中でのAFM観察により，細菌の形態や細胞表面の柔らかさや粘弾性などの物理的性質の分析結果が報告されている^(14～16)14) F. Pillet, L. Chopinet, C. Formosa & É. Dague: Biochim. Biophys. Acta, 1840, 1028 (2014).15) C. Müller & C. Ziegler: Phys. Status Solidi, 210, 846 (2013).16) Y. F. Dufrêne: Nat. Rev. Microbiol., 6, 674 (2008).．また，バイオフィルム，莢膜（カプセル），S-layer，ペプチドグリカン，繊毛，べん毛などの細胞外構造がAFMで観察されている．一方，生細胞を用いたAFM観察例も報告されている．Franciusらは，2008年にStaphylococcus aureusにLysostaphinと呼ばれるペプチドグリカン分解酵素を作用させた際の細胞の形態や物性の変化をAFMにより調べ，この酵素の作用機序を考察している⁽¹⁷⁾17) G. Francius, O. Domenech, M. P. Mingeot-Leclercq & Y. F. Dufrene: J. Bacteriol., 190, 7904 (2008).．また，Fantnerらは，2010年に，大腸菌を用いて抗菌ペプチドの作用で細胞が損傷を受ける様子を13秒／フレームの時間分解能で，タイムラプス観察した結果を報告している⁽¹⁸⁾18) G. E. Fantner, R. J. Barbero, D. S. Gray & A. M. Belcher: Nat. Nanotechnol., 5, 280 (2010).．一方，Plompらは，Bacillus atrophaeusの胞子形成の過程とペプチドグリカンの構造を，培養液中で観察している⁽¹⁹⁾19) M. Plomp, T. J. Leighton, K. E. Wheeler, H. D. Hill & A. J. Malkin: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 9644 (2007).．以上のように，近年，生細胞を用いたAFM観察が行われるようになってきたが，細胞を構成するタンパク質分子の構造が可視化できるほどの高い空間分解能をもつ観察や，生細胞でのタンパク質分子の構造動態の観察は報告されていなかった．そこで，われわれは，高い空間分解能と時間分解能を併せ持つ高速AFMを用いて，生細胞のタンパク質分子構造の観察に挑戦した．本稿では，生細胞を初めて高速AFMで観察した研究として，磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1の外膜構造の観察結果を紹介する⁽²⁰⁾20) H. Yamashita, A. Taoka, T. Uchihashi, T. Asano, T. Ando & Y. Fukumori: J. Mol. Biol., 422, 300 (2012).．M. magneticum AMB-1は，細胞内にマグネトソームと呼ばれる磁気オルガネラをもち，磁気に沿って遊泳する走磁性と呼ばれる特性を有しているが，α-プロテオバクテリアに分類される一般的なグラム陰性細菌の一種である^(21,22)21) C. T. Lefèvre & D. A. Bazylinski: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 77, 497 (2013).22) 福森義宏，田岡　東：生物物理，54, 11 (2014).．これまでグラム陰性細菌の外膜の構造は，電子顕微鏡により観察がなされているが，生きたグラム陰性細菌の外膜の観察結果は報告されていない．

高速AFMで観察した生きた細菌の表層構造

図3図3■M. magneticum AMB-1細胞のAFM像は，上記の方法で固定した細胞を，培養液において低倍率で観察したAFM像である．M. magneticum AMB-1は，長さ2～3 µm，幅およそ0.5 µmのらせん菌である．AFMで観察した細胞の形状，大きさは光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察した結果と矛盾ないものであった．細胞の表面は滑らかであり，マイカ基板への固定や探針の走査により細胞が侵襲を受けていないことがわかる．興味深いことに，細胞表面を高倍率で拡大して観察したところ，細胞の表面は網目のような規則的な構造で被われていた（図4図4■M. magneticum AMB-1の細胞表面構造）．この網目状構造は，細胞全体にわたって隙間なく観察され，細胞表面を完全に被っていた．また，観察したすべての細胞に見ることができた．網目構造の大きさを測定したところ，網目の直径は平均値で，7.3±1.4 nm，窪みの部分の深さは0.85±0.52 nmであった．網目のフレーム部分には，粒々とした突起状の構造が認められ，網目構造を構成する分子の一部と考えられた（図4B図4■M. magneticum AMB-1の細胞表面構造矢印）．本実験で観察された細胞表面構造の水平方向の分解能は2 nm以下であり，生きた細胞の上で得られたAFM像としては極めて高い空間分解能であった．

図3■M. magneticum AMB-1細胞のAFM像

（A, B）液体培地中において低倍率で観察したM. magneticum AMB-1の細胞（矢印）．図中の色の濃さは試料の高さを示している．（C）パネルB白線部の表面プロファイル．

図4■M. magneticum AMB-1の細胞表面構造

（A, B）細胞表面に観察された網目構造の高倍率AFM像．網目のフレーム部分に粒子状の構造が見られる（矢印）．（C）パネルA白線部の表面プロファイル．網目構造のフレーム部分（矢頭）とくぼみ部分（矢印）が規則的に配置されている．

次に，この網目構造の動態を観察するため，細胞表面の網目構造を0.5秒／フレームまたは0.2秒／フレームのイメージング速度で動画観察したところ，網目構造は細胞の表面をゆっくりと水平方向に移動していることがわかった⁽²⁰⁾20) H. Yamashita, A. Taoka, T. Uchihashi, T. Asano, T. Ando & Y. Fukumori: J. Mol. Biol., 422, 300 (2012).（動画は文献20参照）．観察された個々の網目構造の移動には，相関はなくランダムに移動していた．したがって，観察された網目構造の動態は，探針の走査によるアーティファクトではなく，生きた細胞表層における分子動態を捉えたものであることが強く示唆された．網目構造の拡散係数を求めたところ，平均で3.2 nm²／秒であった．これまで報告されている細胞内の可溶性タンパク質⁽²³⁾23) M. B. Elowitz, M. G. Surette, P. E. Wolf, J. B. Stock & S. Leibler: J. Bacteriol., 181, 197 (1999). や膜タンパク質⁽²⁴⁾24) M. Vrljic, S. Y. Nishimura, S. Brasselet, W. E. Moerner & H. M. McConnell: Biophys. J., 83, 2681 (2002). の拡散係数はµm²毎秒のオーダーであり，網目構造の拡散係数は著しく低い．このことから，細菌の外膜の表面は，分子が密に充塡された非常に混み合った環境であるのかもしれない．

精製外膜の微解剖実験

どのような分子が網目構造を構成しているかを調べるため，まず，M. magneticum AMB-1細胞をリゾチーム処理することで得た粗外膜画分をショ糖密度勾配遠心分離法によって分画し，外膜画分を調製した．得られた外膜画分を緩衝液中でAFM観察すると，パッチ状の外膜断片を確認することができた（図5A図5■精製した外膜のAFM観察）．そこで，この外膜由来の膜断片を高倍率でイメージングしたところ，膜パッチ上に網目構造が観察された（図5B図5■精製した外膜のAFM観察）．このことから，網目構造は外膜に局在する分子により構成されていることがわかる．次に，高速AFMを用いて，網目構造の微解剖実験を行った．高速AFMは，走査中に探針から試料に加える力を強くすることで，イメージングを行いつつ観察中の試料に物理的な力を加えることができる．これにより，観察中の試料をナノスケールでいわば解剖することできる．図5C図5■精製した外膜のAFM観察は，膜パッチに観察された網目構造をAFM探針で解剖した後の画像である．探針から加えられた力により，網目構造が解離し，3量体構造をもつ分子（図5D図5■精製した外膜のAFM観察）が現れた．微解剖の様子を撮影した動画については，文献20を参照されたい⁽²⁰⁾20) H. Yamashita, A. Taoka, T. Uchihashi, T. Asano, T. Ando & Y. Fukumori: J. Mol. Biol., 422, 300 (2012).．微解剖実験の結果，この3量体構造の分子が網目構造を構成していることが示された．外膜画分に含まれるタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し，得られたタンパク質バンドを質量分析器で同定したところ，外膜画分に含まれる主要なタンパク質はポーリンであった．そこで，既知のポーリンの結晶構造から，シミュレーションによりポーリンのAFM像を構築し，観察像と比較した．その結果，3量体構造をもつ分子の観察像は，ポーリン分子を細胞外側方向から観察したシミュレーションAFM像とよく一致した．以上の結果から，M. magneticum AMB-1の外膜表面に観察された網目構造は，少なくとも部分的には外膜に最も多く存在するタンパク質であるポーリンによって構成されていることが明らかになった．この外膜表面の網目構造が，M. magneticum AMB-1に特異的な構造であるのか，あるいはグラム陰性細菌に普遍的に存在する構造であるのかを明らかにするため，現在，光合成細菌Rhodobacter sphaeroidesや大腸菌などのプロテオバクテリアに分類されるグラム陰性細菌を用いて，生細胞の外膜表層構造のAFM観察を行っている．

図5■精製した外膜のAFM観察

（A）M. magneticum AMB-1から調製した外膜のAFM像．パッチ状の膜断片の表面に網目構造が観察できる．（B）外膜膜パッチに観察された網目構造の高倍率AFM像．（C）AFM探針による微解剖実験後の外膜膜パッチ．（D）微解剖実験後に観察された分子のAFM像．網目構造が解離して生じた3量体構造をもつ分子が観察できる．

おわりに

本研究では，高速AFMにより生きた細菌表層のナノサイズの構造とその動態を初めて観察した．高速AFMにより明らかになった細菌外膜は，これまで考えられていたランダムに膜タンパク質が埋め込まれた構造とは異なり，分子が規則的に配置され，混み合った環境であることが明らかになった．本稿で紹介した高速AFMによる細菌表層構造の観察法は，多くの細菌で適用可能である．今後は，細菌や単離したオルガネラの表面構造の観察，細胞やオルガネラの表層で起こる物質輸送やウイルスの感染などのさまざまな生命現象の観察に挑みたい．高速AFMにより，生細胞の超分子複合体の構造やその動態を生理的環境下で観察することで，既知の生命現象を詳細に解析するだけでなく，新たな生命現象を見いだすこともできるかもしれない．高速AFMはナノレベルの細胞生物学研究の進展に貢献する新しい解析手段となることが期待される．