1. ケミカルライブラリーとしてのペプチドの多様性

ペプチドはアミノ酸のポリマーである．その配列は極めて重要であり，その配列を最適化することでさまざまな機能をもつペプチドがデザインでき，ペプチドは配列置換によって改良・改変が可能である．われわれは，ペプチド固相合成法という手法で，ペプチドをアレイ状にスポット合成する装置を使っている（図1図1■ペプチドアレイ作製装置（a）と作製原理（b））．これで数百種類のペプチドを合成し，機能性ペプチドを精力的に探索している．ペプチドはアミノ酸20種類の組み合わせであることから6-merであっても6,400万種類にも及ぶ多様性をもつ．19-merでは20の19乗種類になる．これらの種類の分子が，すべて1分子ずつ合成できたとすると，約40 kg，37-merでは6×10²⁷ gとなり，地球と同じ重量となる．また単分子膜が形成できるとすれば1 gで1,000 m²に達し，17-merのワールド（約45 g）で，野球場のグラウンドの面積（13,000 m²）の3倍に達する．このような膨大なバリエーションをもつペプチドワールドは，医薬品原薬や機能性食品素材のリード化合物探索のためのライブラリーにふさわしいと考えられる．

図1■ペプチドアレイ作製装置（a）と作製原理（b）

作製装置はシリンジポンプにつながったX-Yスポッターであり，コンピュータ制御で目的の位置にアミノ酸をスポッティングできる．具体的なペプチド合成原理はFmoc固相合成法である．

後述するように，私たちはタンパク質などの生体分子と結合して機能するペプチドを多数探索した．細胞に結合して細胞死や増殖分化シグナルを伝えるペプチドも探索した．たとえば，コレステロールの吸収は，腸管内でコレステロールを巻き込んだ胆汁酸ミセルを形成し吸収される．われわれが探索したコレステロール吸収阻害ペプチド（たとえばPWWWMY）は，疎水性分子である胆汁酸の一種，タウロコール酸（log P値＝2.2の疎水性分子）に結合できる⁽¹⁾1) T. Takeshita, M. Okochi, R. Kato, C. Kaga, Y. Tomita, S. Nagaoka & H. Honda: J. Biosci. Bioeng., 112, 92 (2011).，比較的疎水性の高い分子である．アミラーゼ阻害ペプチド（RHWYYRYW）はαアミラーゼの多糖結合ポケットに先回りして結合できる⁽²⁾2) T. Ochiai, T. Sugita, R. Kato, M. Okochi & H. Honda: Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 819 (2012).，多糖構造を模倣できるペプチドである．タンパク質分子を形成するL型のアミノ酸に限ってみても，その疎水度は，log P=−4.2（アルギニン）から−1.05（トリプトファン），等電点は，10.76（アルギニン）から2.77（アスパラギン酸）である．さらにペプチド結合でポリマーになれば，疎水性は増し，等電点は変更可能である．ケミカルライブラリーとしての可能性が感じられる．特に“生体内分子と結合して機能を発揮するリード化合物を探索する”という現場においてはよりいっそう魅力的である．

実際に，ペプチドは短鎖でも機能性をもつものが知られている．血圧安定化作用を示すペプチド（ラクトトリペプチド）や細胞接着ペプチド（RGD）はその好例である．われわれは，この魅力的な，そして非常に膨大なワールドを探索フィールドにするため，①まず数百種類の短鎖ペプチドをペプチドアレイにより合成し，機能性ペプチドを探索する，②次にそれらの機能性ペプチドの特徴を，特定位置のアミノ酸の特徴で説明するという探索法を提案している．この方法をPeptide informaticsと呼んでいる^(3,4)3) C. Kaga, M. Okochi, Y. Tomita, R. Kato & H. Honda: Biotechniques, 44, 393 (2008).4) 本多裕之，生物工学会誌，87, 280 (2009)．光解裂するフォトリンカーを使った遊離ペプチド探索系や細胞を使った評価系も構築している．本稿では，これらのペプチド探索法を使った“ペプチドケミカルライブラリー”の可能性に関して紹介する．

2. ファージディスプレイとの比較

機能性ペプチドの探索では，多くの研究者がファージディスプレイ法を試みている．この方法はキット化されていて利用しやすい．しかし，一方で，ファージディスプレイ法でのスクリーニングに不安を感じている研究者は少なくない．確かに結合するペプチドは得られたけれど，果たして本当にこれが最良のペプチドなのか（検出漏れの危険性），これ以外に同様の活性をもつペプチド配列はないのか（類似性の危険性）という不安である．

われわれは，ファージディスプレイ法で得られた金属微粒子ZnOを認識するペプチドEAHVMHKVAPRPをシード配列にして，組成が同じで配列の異なる類縁体ペプチドをペプチドアレイに合成し，ZnOとの認識能を評価した．その結果，HPVPRHMVAEAKやKAEAHVPMHVPRがシード配列より高い認識能をもつことを発見した⁽⁵⁾5) M. Okochi, T. Sugita, S. Furusawa, M. Umetsu, T. Adschiri & H. Honda: Biotechnol. Bioeng., 106, 845 (2010).．また，シード配列を元にして6-merのペプチドを探索したところ，2種類の重要部位HVMHKV，HKVAPRの特定に成功し，さらにHKVAPRの残基置換によりHCVAPRという非常に高結合を有するペプチドの探索に成功した．これは，（ⅰ）ファージディスプレイ法による探索が万能ではなく，スクリーニング漏れがあり，また（ⅱ）同程度の機能をもつ短鎖ペプチドが実際に存在することを示している．検出漏れは，発現困難なペプチドであったためかもしれないし，ファージ表面タンパク質と発現ペプチドとの相互作用が無視できないためかもしれない．短鎖でも良いものがあるのは，酵素–基質の認識が3から4個のアミノ酸残基で起きることにつながると考えている．

3. 受容体ライブラリーによる探索

注目するタンパク質に結合して機能を発揮するペプチドをどのように探索するかは重要である．受容体（レセプター）が知られているタンパク質では，そのリガンド機能を代替するペプチドを探索するため，受容体のアミノ酸配列から探索するのが適切であろう．

われわれは，アンジオテンシン結合ペプチドの探索のためにアンジオテンシン受容体のアミノ酸配列を網羅した8-merのペプチドライブラリーを作製した．アンジオテンシンをFITCで蛍光ラベルし，結合するペプチドを探索した結果，46から56残基目までの領域，NSLVVIVIYFYが特に強く結合した．さらに絞り込んだ結果，6残基のVVIVIYで十分であり，ラット大動脈組織を使った血管収縮作用を84%抑制できることを明らかにした⁽⁶⁾6) R. Kato, M. Kunimatsu, S. Fujimoto, T. Kobayashi & H. Honda: Biochem. Biophys. Res. Commun., 315, 22 (2004).．

抗体は生化学検査だけでなく，抗体医薬として注目される重要な生体分子である．われわれはそのFc領域に結合するペプチドをFcγ受容体配列から探索することを試みた．細胞表面に存在するFcγ受容体はⅠ，Ⅱ，Ⅲの3種類があるため，それらの配列を網羅した全740種類の6-merペプチド受容体ライブラリーを作製し，IgG-Fc認識ペプチドを探索した．その結果，図2図2■6-merからなるFcγ受容体ペプチドライブラリーの作製とIgG-Fc認識ペプチドの探索に示すように，3種類の高結合配列が探索できた⁽⁷⁾7) T. Sugita, M. Katayama, M. Okochi, T. Ichihara, R. Kato & H. Honda: Biochem. Eng. J., 79, 33 (2013).．

図2■6-merからなるFcγ受容体ペプチドライブラリーの作製とIgG-Fc認識ペプチドの探索

4. ペプチドアレイ細胞機能アッセイ法

上記のように，リガンドの結合をin vitroで評価することが可能な場合は，蛍光ラベルしたリガンドが利用できるため探索しやすい．しかし，単離精製が困難なレセプターで容易にin vitroアッセイ系が構築できない場合や，ターゲットになるレセプターが特定されていない場合は，細胞を使って直接評価する方法が必要である．そこでわれわれは，アレイ表面のペプチドと細胞表面上の受容体（ex.インテグリン）を直接相互作用させることで，シグナル伝達に伴って引き起こされる細胞の変化（ペプチドの機能）を直接検出できる“Peptide array-cell assay system”を開発した⁽⁸⁾8) R. Kato, C. Kaga, M. Kunimatsu, T. Kobayashi & H. Honda: J. Biosci. Bioeng., 101, 485 (2006).．これは，合成したペプチドアレイを十分に乾かした後，Biopsy Punchを用いて直径6 mmのディスク状にくり抜き，96穴の培養プレートに沈め，細胞を播種した後一定時間後の生細胞数をカルセインAMで検出する方法である．

がん細胞を選択的にアポトーシス（周囲の正常な組織に影響を与えない細胞死）に誘導するタンパク質としてTRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）が知られている．TRAIL配列ライブラリーを作製し，上記の方法で探索を行ったところ，TRAILと同様な機能をもったペプチドとしてRNSCWSKD配列を発見した⁽⁹⁾9) M. Okochi, M. Nakanishi, R. Kato, T. Kobayashi & H. Honda: FEBS Lett., 580, 885 (2006).．これ以外に，FASリガンドを代替する細胞死誘導ペプチドCNNLPの探索にも成功している⁽¹⁰⁾10) R. Kato, Y. Okuno, C. Kaga, M. Kunimatsu, T. Kobayashi & H. Honda: J. Pept. Res., 66 (Suppl. 1), 146 (2006).．

間葉系幹細胞（MSC: mesenchymal stem cell）は骨芽細胞・脂肪細胞・軟骨細胞・筋細胞などに分化することができる分化能と自己複製能を併せ持つ細胞で，再生医療に有効な細胞である．しかし，MSCは骨髄中にわずかしか存在しないため少量の細胞を効率良く接着・増殖させることが重要である．われわれはフィブロネクチンのアミノ酸配列をもとに6残基ペプチドライブラリーを作製し，MSC接着ペプチドの探索を行った．その結果，細胞接着ペプチドとして知られているRGDと同などの活性をもった配列ALNGRを探索することに成功した⁽¹¹⁾11) M. Okochi, S. Nomura, C. Kaga & H. Honda: Biochem. Biophys. Res. Commun., 371, 85 (2008).．

コラーゲンタイプⅣ（Col IV）は動物の組織において上皮細胞層と間質細胞層を分ける基底膜に存在する主要な細胞外マトリックスである．そこで，血管内皮細胞（Endothelial cell; EC）と平滑筋細胞（Smooth muscle cell; SMCs）に選択的に接着するペプチドを探索するため，Col IVに存在するトリペプチドのペプチドライブラリーを作製し，細胞の接着評価を行った．フィブロネクチン中に存在し，細胞選択性を示さない細胞接着トリペプチド，RGDを比較のため同時に評価した．その結果，配列CAGのトリペプチドが最もEC選択性が高いことがわかり，CAGを含浸させたPCL（poly-ε-caprolactone）のシートを作製したところ，EC接着性が非常に高いシートであることがわかった⁽¹²⁾12) K. Kanie, Y. Narita, J. Owaki, Y. Zhao, F. Kuwabara, M. Satake, S. Honda, H. Kaneko, T. Yoshioka, M. Okochi et al.: Biotechnol. Bioeng., 109, 1808 (2012).（図3図3■細胞選択性ペプチドの探索）．

図3■細胞選択性ペプチドの探索

a）Col IV特異的ペプチドに対する血管内皮細胞（EC）選択性，b），c），d）走査電子顕微鏡写真（b: PCLシート上のEC細胞，c: CAG含浸PCLシート上のEC細胞および，d: CAG含浸PCLシート上のSMC細胞），EC細胞はCAG含浸PCLシート上で高い接着性を示しSMC細胞はあまり接着していない．

これらの結果からペプチドアレイを用いた細胞アッセイ法が機能性ペプチド探索手法として有用であることが確認された．

5. アミノ酸配列の残基置換

上述の機能性ペプチドはいずれも生体内に存在するタンパク質由来のアミノ酸配列である．ペプチドのバリエーションから考えると生体内に存在しない機能未知のペプチドは無数にあると考えられる．そこで，探索した実在のタンパク質上のアミノ酸配列を置換して，全く新規の機能性ペプチドの探索を試みた．

上述のIgG–Fc結合ペプチドとして探索した配列に関して，アミノ酸組成を変えずに配列置換したペプチドを合成して結合活性を評価した．FcγRI由来のYRNGKAFKFFHWという12-merの高結合配列からは8-merペプチドNARKFYKGが，またFcγRIII由来のNGKGRKYFからはNKFRGKYKという高結合活性を示すペプチドが得られた．NKFRGKYKおよびNARKFYKGのIgGへの結合定数は，8.9×10⁶および6.5×10⁶ M⁻¹と非常に高く，IgGの精製に使えるだけでなく⁽⁷⁾7) T. Sugita, M. Katayama, M. Okochi, T. Ichihara, R. Kato & H. Honda: Biochem. Eng. J., 79, 33 (2013).，その相補配列と組み合わせることでIgG検出に使えることを明らかにした⁽¹³⁾13) T. Sugita, M. Okochi & H. Honda: Chem. Lett., 43, 550 (2014).．

上述の細胞死誘導ペプチドRNSCWSKDも改変ペプチドを合成し，評価した．各アミノ酸残基をそれぞれほかの19種類に置換した配列（たとえばANSCWSKDなど），全152配列を作製した（19種類×8カ所＝152種類）．細胞死活性を評価した結果，さらに高い活性をもつ配列CNSCWSKDを得た．この配列は元の配列RNSCWSKDより5倍程度活性が高かった⁽¹⁴⁾14) C. Kaga, M. Okochi, M. Nakanishi, H. Hayashi, R. Kato & H. Honda: Biochem. Biophys. Res. Commun., 362, 1063 (2007).．