背景

近年，食の健康機能性に関する研究は産官学いずれの分野でも極めて活発に行われている．そのような健康機能性研究において乳酸菌は最も多く対象として取り上げられている素材の一つであるが，おそらくその根底には①安全性における懸念が比較的少ないこと，②取り扱いが容易であること，③コスト・味覚面含めた食品適性が高く事業化への道筋が描きやすいこと，などの背景要因が寄与していると思われる．機能の多さにも特筆すべきものがあり，これまでに報告されている機能性として，整腸作用・腸内細菌叢改善，アレルギー改善，がん予防，コレステロール低減，抗肥満効果，認知機能改善効果，感染防御効果などが報告されている．これらのうちアレルギー・がん・感染防御といった機能は免疫に関するものであり，これは乳酸菌が菌体成分として，TLR（Toll-like receptor）リガンドであるリポテイコ酸・ペプチドグリカン・核酸，NLR（Nod-like receptor）リガンドであるムラミルジペプチド，などの免疫刺激物質を数多く含むことから考えて，さまざまな免疫を介した形質が現れることは合理的である．

季節性インフルエンザやノロウイルス感染症などの従来のリスクに加えて，温暖化という地球規模での環境の変化やヒト・モノのグローバルかつスピーディな移動に端を発した①ウイルス流行地域の拡大，②ウイルス種の増加，などウイルスに関連したリスクは飛躍的に増大しつつある．直近の話題では，昨年約70年ぶりに国内でデングウイルスが検出されたり，2009年にブタ由来新型インフルエンザが流行し国内インフラがマヒ状態に陥ったりしたことは記憶に新しい．このようななか，高度情報化社会ならではの多種多様なストレスは，日常生活のなかでエアポケットのような免疫力が著しく低下した時間を作り出すリスクがある．そこで食からのアプローチとして，ウイルスに対して免疫力を高めることによって感染時の発症率を低下させる，あるいは重症化を防ぐといった効果が得られれば非常に有用である．

乳酸菌の免疫刺激機能は，主にマクロファージやミエロイド樹状細胞（myeloid dendritic cell; mDC）といった自然免疫系によって菌が貪食され，IL-12に代表される各種炎症性サイトカインが発現する結果，呼応する免疫機能が活性化される．この免疫賦活効果によって得られるベネフィットのうち，最も代表的なものが感染防御効果である．

感染防御機構の最前線を担う自然免疫系のうち最も重要な細胞として，獲得免疫系への抗原提示機能を担う樹状細胞が挙げられるが，大別すると上述のmDCとプラズマサイトイド樹状細胞（plasmacytoid dendritc cell; pDC）の2つに分類することができる．pDCはヒト末梢血単核球の1%にも満たない極めてマイナーなサブセットである⁽¹⁾1) V. Hoene, M. Peiser & R. Wanner: J. Leukoc. Biol., 80, 1328 (2006).が，ウイルス感染防御の司令塔とも言える極めて重要な細胞であることがわかってから大きな注目を集めている．pDCはウイルス核酸を認識するTLR7やTLR9を細胞内に高発現しており，ウイルス感染を認識して大量のIFN-αおよびIFN-βといったtype Iインターフェロンを放出する．type Iインターフェロンは2–5Aシステムと呼ばれるウイルス複製阻害機構を活性化し，直接的な抗ウイルス効果を発揮する⁽²⁾2) A. J. Sadler & B. R. G. Williams: Nat. Rev. Immunol., 8, 559 (2008).．さらにpDCは，CD8⁺T細胞，CD4⁺T細胞，B細胞など特定のウイルスを認識して生体から排除する獲得免疫系を活性化することができる．獲得免疫系は感染後期の免疫応答を担い，生体からの最終的なウイルスクリアランスを遂行する．このほか，pDCが産生するtype Iインターフェロンは自然免疫の一部であるNK細胞の活性化必須因子として感染初期応答を制御している．このようにpDCはウイルス感染初期および後期の免疫応答を制御する極めて重要な役割を果たしている．実際，pDCを欠損させたマウスでは，ウイルス抗原に対するCD8⁺T細胞の応答反応・IFN産生が起こらなくなるなど重篤な抗ウイルス機能における欠陥が起こることが確認され，その重要性が浮き彫りになっている⁽³⁾3) H. Takagi, T. Fukaya, K. Eizumi, Y. Sato, K. Sato, A. Shibazaki, H. Otsuka, A. Hijikata, T. Watanabe, O. Ohara et al.: Immunity, 23, 958 (2011).．

pDC活性化乳酸菌の探索

われわれは研究開始に先立って，食品適性が高く，免疫を刺激しうる乳酸菌というポテンシャルの高い素材が仮にウイルス感染防御の司令塔たるpDCを活性化できれば非常に有用であると考えた．そこで，pDC活性化乳酸菌の探索を行うこととしたが，前述のようにヒトpDCは末梢血からわずかしか取得できず，マウスにおいてもpDCを選択的に誘導する系が確立されていないことから，マウス骨髄細胞から誘導するpDC/mDC混合培養細胞を用いて，スクリーニングを行うこととした．pDCの活性化指標としては，mDCがほとんど産生できないIFN-αを用いた．

31菌種からなる計125株の乳酸菌株をpDC/mDC培養細胞に死菌体として添加し，IFN-αの産生量をELISA測定したところ，ほとんどの乳酸菌株で産生は検出されず，一般的に乳酸菌株にはpDC刺激能がないことが判明した．この点，mDC／マクロファージは大半の乳酸菌が活性化可能であること⁽⁴⁾4) D. Fujiwara, S. Inoue, H. Wakabayashi & T. Fujii: Int. Arch. Allergy Immunol., 135, 205 (2004).と対極的であった．しかし，3株において100 pg/mL以上，13株において50 pg/mL以上のIFN-α産生が認められた（表1表1■マウス骨髄由来pDC/mDC培養細胞におけるIFN-α産生誘導乳酸菌）．非常に興味深いことに100 pg/mL以上の産生を誘導した3株はすべてLactococcus lactis subsp. lactisに分類され，50 pg/mL以上の産生誘導を示した株もすべて乳酸球菌に分類されるものであった．ただし，乳酸球菌でも多くの場合で活性は検出されなかった．このことは，球菌であることがpDC活性化の必要条件であることを示唆している．

その後の解析により，100 pg/mL以上の産生を誘導した3株のうち最も安定にpDCを活性化しうる菌としてLactococcus lactis subsp. lactis JCM5805株を選択し，さらなる解析を行った⁽⁵⁾5) K. Jounai, K. Ikado, T. Sugimura, Y. Ano, J. Braun & D. Fujiwara: PLoS ONE, 7, e32588 (2012).．

JCM5805株のin vitroにおけるpDC活性化効果

JCM5805株をin vitroでマウス骨髄由来pDC/mDC培養細胞に添加した場合の効果を図1図1■JCM 5805添加によるpDC上表面分子の発現の変化に示す．ポジティブコントロールとしてTLR9を介してpDC活性化することがわかっているCpG DNAを用いた．JCM5805株添加によってCpG DNA同様にMHC class IIをはじめとするpDC活性化マーカーの発現亢進が認められた．また，同時に制御性T細胞の誘導にかかわることが報告されているICOS-LやPD-L1の上昇も認められた．すなわち，JCM5805株はpDCを活性化させる一方で過剰な免疫活性化を防ぐ仕組みを働かせることができることを示唆している．

図1■JCM 5805添加によるpDC上表面分子の発現の変化

pDC培養細胞に乳酸菌ないしはCpG DNAを添加し，培養後フローサイトメーターにて細胞表面マーカーの発現を観察した．* 無添加サンプルに対してp<0.05で有意差あり，MFI: Median Fluorescence Intensity．

さらに産生するIFNsの濃度について測定を行ったところ，図2図2■乳酸菌株のpDCへの添加によるIFNs誘導産生量比較に示すように，JCM5805株添加によりIFN-α以外にIFN-β，IFN-λの誘導が認められた．これらのサイトカイン産生は対照乳酸菌株（Lactobacillus rhamnosus）の添加によっては起こらず，改めてJCM5805株が特異なサイトカイン誘導能をもっていることを示唆している．一方で，type II IFNであるIFN-γについてはJCM5805株と対照乳酸菌で同等の誘導効果を示しており，この点に関しては一般的な乳酸菌と同様な機構で誘導されているものと思われた．

図2■乳酸菌株のpDCへの添加によるIFNs誘導産生量比較

pDC培養細胞に乳酸菌ないしはCpG DNAを添加し，培養後ELISAにて各種IFNsの産生量を測定した．* 無添加サンプルに対してp<0.05で有意差あり，Pam₃CSK₄=TLR2L，LPS=TLR4L，CpG-A=TLR9Lの各ポジティブコントロール，対照乳酸菌=Lactobacillus rhamnosus ATCC53103株．

近年，抗ウイルス効果においてIFN-α，IFN-βといったtype I IFNに加えて，type III IFNであるIFN-λが脚光を浴びており，特にロタウイルスのような腸管感染性ウイルスの排除に重要であることも示されている⁽⁶⁾6) J. Pott, T. Mahlakõiv, M. Mordstein, C. U. Duerr, T. Michiels, S. Stockinger, P. Staeheli & M. W. Hornef: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 7944 (2011).．このことは，特に乳酸菌のような食素材は腸管に直接届くため，特に有用な形質であると考えられる．

JCM5805株のIFN-α産生誘導メカニズムの解析

JCM5805株のpDC活性化において必須なTLRシグナルを探索するため，各種TLRノックアウト（KO）マウスを用いた解析を行った．その結果，TLR9 KOマウスおよびMyD88 KOマウス由来のpDCでは完全に消失した（図3図3■IFN-α産生におけるTLR関連KOマウスでのJCM 5805添加の効果）ことから，JCM5805株はTLR9/MyD88シグナルを介してIFN-α産生誘導していることが示唆された．TLR9のアゴニストとしては前述のCpG DNAが知られており，JCM5805株においてもDNAが活性本体であることが考えられた．そこで，対照乳酸菌およびJCM5805株由来DNAのIFN-α誘導活性を検討したところ，JCM5805株由来DNAは特に強い活性を示した（data not shown）．したがって，JCM5805株固有のDNA配列がTLR9リガンドとなってpDC活性化を誘導することが示唆された．また，TLR4 KOマウス由来のpDCでは部分的な抑制が観察され，おそらく細胞壁成分もTLR4を介して協調的に働いていることも示唆された．

図3■IFN-α産生におけるTLR関連KOマウスでのJCM 5805添加の効果

各種KOマウス骨髄からpDCを誘導，乳酸菌ないしはCpG DNAを添加し，培養後ELISAにてIFN-α量を測定した．* 野生型（WT）マウス由来DCにおける反応に対してp<0.05で有意差あり．

TLR9はエンドソームに発現する内在性レセプターであり，pDCがJCM5805株を貪食し，菌体中のDNAが溶出しなければリガンドとして作用することができない．すなわち機能を発揮するうえで，pDCに貪食されるかどうかが重要と思われた．そこで，蛍光ラベルしたJCM5805株をpDCに添加し，蛍光顕微鏡観察を行った．その結果，図4図4■乳酸菌のpDCによる取り込みの違いに示すように対照乳酸菌はpDC外部を取り囲むように分布し，細胞内部に取り込まれないのに対して，JCM5805株はpDCの内部に取り込まれることがわかった．なぜこのようにpDCへの取り込みが乳酸菌菌株の違いによって大きく異なるのかについては，現在研究中である．

図4■乳酸菌のpDCによる取り込みの違い

pDC培養細胞に蛍光標識した乳酸菌を添加し，蛍光顕微鏡観察を行った．

JCM5805株の経口投与によるin vivo pDC活性化効果

食品としての有効性を考えたときに，経口投与でin vivoにおいてpDCの活性化が実際に起こるかどうかは，たいへん重要なポイントである．そこで，マウスに経口投与し，腸管所属リンパ節のpDCが活性化しうるかどうかを検討した．その結果，腸間膜リンパ節pDCのMHC class IIおよびCD86の発現量がJCM5805株摂取群で有意に上昇することが示された（図5図5■JCM 5805摂取1週間後の腸間膜リンパ節pDCの活性化度）．このことからJCM5805株の摂取により，in vivoでpDCが活性化されることが示唆された．

図5■JCM 5805摂取1週間後の腸間膜リンパ節pDCの活性化度

マウスにJCM5805を経口摂取させた後，腸間膜リンパ節中のpDC活性化度合をフローサイトメーターで観察した．

JCM5805株のヒトに対する効果

次にヒト細胞に対する効果を検討した．まず，ヒト末梢血単核球に対してin vitroでJCM5805株を添加しpDCの活性化の有無を調べた．その結果，図6図6■ヒトpDCに対する乳酸菌添加効果に示すように2例のドナーどちらにおいてもJCM5805株添加によってpDC上の活性化マーカーの有意な上昇が認められた．

図6■ヒトpDCに対する乳酸菌添加効果

上段・下段にそれぞれのドナー由来pDCの反応を示した．ヒトpDCに乳酸菌あるいはCpG DNAを添加後，フローサイトメーターで細胞表面マーカーの発現量を測定した．*,** 無添加に比べてそれぞれp<0.01, 0.05で有意差あり．

さらにヒトにおけるJCM5805株摂取の効果を検討するために，健常人ボランティアを対象とした二重盲検試験を行った⁽⁷⁾7) T. Sugimura, K. Jounai, K. Ohshio, T. Tanaka, M. Suwa & D. Fujiwara: Clin. Immunol., 149, 509 (2013).．20代から50代の被験者38名を無作為に19名ずつ2グループに分け，それぞれJCM5805株を含む食品，またはプラセボ食品を4週間（2011年8月）飲用させた．試験開始時，終了時に採血を行い，末梢血単核球中のpDC活性化度をHLA-DRおよびCD86の発現量で評価した（図7図7■JCM 5805含有食品摂取のヒトpDCに対する効果）．その結果，本試験期間中両グループでpDC活性は低下する傾向があったが，JCM5805株を含む飲料摂取グループではpDCの低下が小さく留まり，試験終了時にHLA-DR・CD86ともにプラセボグループに比べて有意に高い値を示した．本試験は盛夏期間に行われたが，樹状細胞の活性は温度ストレスによって低下することが知られている⁽⁸⁾8) Y. Jin, Y. Hu, D. Han & M. Wang: J. Biomed. Biotechnol., 2011, 367846 (2011).．このことから，ヒトにおいてJCM5805株を経口摂取することによりpDC活性が低下するような環境・コンディションにおいても平常値に維持されることが示唆された．

図7■JCM 5805含有食品摂取のヒトpDCに対する効果

健常人ボランティアにプラセボないしはJCM5805を含有する食品を摂取させ，開始前後の血中pDC活性化度合をフローサイトメーターで測定した．* 両グループ間にp<0.05で有意差あり．

動物を用いたパラインフルエンザウイルス感染実験

JCM5805株の経口摂取により，ヒトpDC活性を維持する効果が認められたが，実際にウイルス感染防御効果をどの程度発揮するのかをヒトにおいて詳細に検討するのは極めて困難である．そこで，マウスおよびパラインフルエンザウイルスを用いて致死率をはじめとするウイルス感染防御効果を検討することとした．

マウスを無作為に2群に分け，JCM5805株摂取・非摂取群とした．摂取量は1 mg／日に設定し，混餌投与した．投与開始から2週間後，両群のマウスに対して致死量のパラインフルエンザウイルスを経鼻感染させた．その結果，図8図8■マウスパラインフルエンザウイルス感染モデルにおけるJCM5805株経口投与の効果に示すように感染10日以内にJCM5805株非摂取群のマウス12匹は全滅したが，JCM5805株摂取群では13匹中9匹が試験終了まで生存した⁽⁹⁾9) K. Jounai, T. Sugimura, K. Ohshio & D. Fujiwara: PLoS ONE, 10, e0119055 (2015).．ウイルス感染3日後の肺組織病理切片像を図9図9■感染初期の肺胞域病理切片に示す．非摂取群のマウスの肺では顕著な好中球の浸潤が認められ気道の閉塞が起こっているが，JCM5805株摂取群では細胞の浸潤の明らかな低下が観察された．以上の結果，pDCを活性化させるJCM5805株の摂取により顕著なウイルス感染防御能を獲得できることが示唆された．

図8■マウスパラインフルエンザウイルス感染モデルにおけるJCM5805株経口投与の効果

2週間前からJCM5805株を含む餌あるいは含まない餌を投与し，ウイルス感染させ，生存率を測定した．** p<0.01で有意差あり．

図9■感染初期の肺胞域病理切片

感染3日後の両群より無作為に選択したマウスの肺組織をヘマトキシリン・エオジン染色した．

そのメカニズムの解明のため，JCM5805株を摂取させたマウスの腸管および肺組織の解析を行った．その結果，経口摂取されたJCM5805株は小腸パイエル板上皮直下，さらに粘膜固有層に取り込まれていることが判明した（data not shown）．さらに非常に興味深いことに，腸管から遠く離れた肺組織中におけるインターフェロン誘導性抗ウイルス因子の発現量がJCM5805株摂取群で上昇していた（図10図10■JCM5805株摂取マウスの肺組織中抗ウイルス因子の発現）．すなわちJCM5805株は経口摂取することにより，ウイルス増殖局所である肺の免疫反応を強化することができ，その結果パラインフルエンザウイルス感染に対して強い抵抗性を示したものと考えられる．

図10■JCM5805株摂取マウスの肺組織中抗ウイルス因子の発現

2週間前からJCM5805株を含む餌あるいは含まない餌を投与し，肺組織中の各種抗ウイルス因子の発現量をRT-PCRで測定した．補正にはGAPDHを用いた．*,** 非摂取群に比べてそれぞれp<0.01, 0.05で有意差あり．

JCM5805株の抗ウイルス反応制御機構に関する考察

冒頭に述べたようにpDCの抗ウイルス免疫における重要な役割が次々と明らかになっており，pDCを直接活性化しうるJCM5805株の可能性は大きい．その想定作用機構について図11図11■JCM5805株の想定作用メカニズムに示す．よく知られているように一般的に乳酸菌はマクロファージやmDCを活性化するため，一連の細胞性免疫反応を賦活することができ，Th1細胞さらにはNK細胞の活性化が期待できる．それがウイルス初期感染時に重要な自然免疫応答能を高めることにつながれば，一定の抗ウイルス効果が得られることが考えられる（図11A図11■JCM5805株の想定作用メカニズム）．これに比して，pDCはウイルスに対する特異的な免疫系，たとえばウイルス抗原特異的なCD8⁺T細胞，B細胞をも制御することが可能な点が大きく異なる．すなわち，pDCはそれ自身がウイルスに対する自然免疫応答であるだけでなく，獲得免疫応答のブリッジ役をも果たしているのである．したがって，pDCを活性化しうるJCM5805株はウイルス排除にかかわるさまざまな免疫応答を一義的に賦活化する可能性があり，したがってこれまで述べたような顕著な抗ウイルス効果が発揮されたと考えている（図11B図11■JCM5805株の想定作用メカニズム）．

図11■JCM5805株の想定作用メカニズム

おわりに

JCM5805株はLactococcus lactis subsp. lactisに分類される菌であり，この菌種は広くチーズ製造のスターターとして用いられる．したがって生菌として利用するとチーズ様の匂い（ダイアセチル）が強く発生するが，今回見いだしたpDC活性化効果は死菌・生菌どちらでも同等レベル認められるため，死菌として利用することにより発生する香気に対する懸念がなくなり，さまざまな形態に加工することが可能となる．

ウイルス感染リスクが拡大している昨今，手軽な手法で免疫力を高めることにより感染リスクを低下させるあるいは重症化を防ぐというアプローチは有用であると考えており，さらなるJCM5805株の抗ウイルス免疫賦活機能の解明を進めていきたい．