1. 雄効果フェロモン

特定の季節にしか繁殖することができない季節繁殖動物であるヤギやヒツジなどでは，非繁殖期の雌の群れに雄を導入すると雌の卵巣活動が賦活され，排卵に至ることが古くから知られており，雄効果（male effect）と呼ばれている．またこの効果は雄の被毛だけを雌に呈示しても再現されることから，被毛には雌の性腺活動を賦活する雄効果フェロモンが含まれていることが推察されていた⁽¹⁹⁾19) T. W. Knight & P. R. Lynch: Anim. Reprod. Sci., 3, 133 (1980).．そこで筆者らは，実験動物であるシバヤギをモデルとして用い，雄効果フェロモンの同定を目指すこととした．

2. 生物検定系の確立

フェロモンが誘起する表現型に着目してフェロモン分子を絞り込んでいくためには，さまざまな候補物質が着目している表現型を誘起するかを確認する，生物検定と呼ばれる操作を繰り返し実施する必要がある．雄効果フェロモンの表現型として雌ヤギの排卵を観察することが最も直接的であるが，当時の超音波技術では高い精度で排卵を確認することは困難であった．また血液中のホルモン動態から排卵を推測することも可能であるが，フェロモン呈示後に排卵する時期（フェロモン呈示の10日から13日後程度）を正確には予測できないため，すべての期間において経時的にホルモン濃度を測定するというように，多大な労力とコストを要する方法となることから，こちらも非現実的な生物検定系と考えられた．

雌の性腺活動は，脳の視床下部より分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（Gonadotropin releasing hormone; GnRH）によって制御されていることが知られている．視床下部より分泌されたGnRHは下垂体に作用し黄体形成ホルモン（Luteinizing hormone; LH）の分泌を促し，分泌されたLHが卵巣を活性化する．このGnRHは常に一定量が放出されているのではなく，周期的（パルス状）に分泌されており，分泌パルスが低頻度のときには卵巣活動が停滞する一方で，パルスが高頻度になると卵巣活動が活発化し排卵に至るというように，GnRH分泌のパルス頻度が卵巣活動を支配している．しかしこのパルス頻度は，GnRH分泌細胞自身が決定しているわけではないと考えられている．卵巣の活動状態は，卵巣より分泌される雌性ホルモンであるエストロジェンなどを介して視床下部にフィードバックされるが，GnRHを分泌する細胞自身にはエストロジェンの受容体が存在しないことから，GnRH分泌細胞より上位に存在しその活動を制御しているGnRHパルスジェネレーターという神経機構の存在が想定されている⁽²⁰⁾20) Y. Wakabayashi, T. Nakada, K. Murata, S. Ohkura, K. Mogi, V. M. Navarro, D. K. Clifton, Y. Mori, H. Tsukamura, K. Maeda et al.: J. Neurosci., 30, 3124 (2010).（図2図2■雄効果フェロモン同定に必要となる生物検定系の確立）．そこで筆者らは，雄効果フェロモンが排卵を誘起するのはフェロモンが雌ヤギのGnRHパルスジェネレーターを活性化させた結果であると考え，パルスジェネレーターの活動をフェロモン効果の表現型として使用できるかということについて検討した．

図2■雄効果フェロモン同定に必要となる生物検定系の確立

候補成分のフェロモン活性を評価するために，GnRHパルスジェネレーターの活動をMUA（Multiple Unit Activity）として計測した．

パルスジェネレーターの活動を電気生理学的に観測するために，電極を雌ヤギの弓状核というパルスジェネレーターが存在すると考えられている脳領域へ設置し，複数ニューロンのユニット活動（Multiple Unit Activity; MUA）を計測したところ，活動の一過性上昇（MUAボレー）がパルス状に観察された．またこのMUAボレーのパルスはLHの分泌パルスと同期していたことからも，観察したパルスがGnRHパルスジェネレーターの活動であることが考えられた⁽²¹⁾21) Y. Mori, M. Nishihara, T. Tanaka, T. Shimizu, M. Yamaguchi, Y. Takeuchi & K. Hoshino: Neuroendocrinology, 53, 392 (1991).．次に，排卵が遅延していた雌ヤギに雄ヤギの被毛を嗅がせたところ，MUAボレーのパルス頻度が増加し，排卵を示唆するホルモン動態が確認されたこと（図3A図3■MUAボレーを指標とした雄効果フェロモンの同定）から，雄効果フェロモンはGnRHパルスジェネレーターの活動を増加させることで排卵を誘起していることが示唆された．さらに，卵巣を摘出した雌ヤギに雄ヤギの被毛を嗅がせたところ，即座にMUAボレーが誘起されることが明らかとなり，呈示した後に即座にMUAボレーが誘起されるという表現型をフェロモン効果の指標として用いることが可能となった⁽²²⁾22) T. Hamada, M. Nakajima, Y. Takeuchi & Y. Mori: Neuroendocrinology, 64, 313 (1996).．

図3■MUAボレーを指標とした雄効果フェロモンの同定

A：排卵遅延が認められた雌ヤギに雄ヤギ被毛を呈示すると，MUAボレーの間隔が短縮し（GnRHのパルス分泌が促進され），その後排卵が確認された．B：MUAボレー周期の中間で18成分カクテルを呈示すると，直ちにMUAボレー（GnRHのパルス分泌）が誘起され，下垂体よりLHが追随して分泌された．

3. フェロモン分子の同定

フェロモン分子の同定に向けて，まずフェロモン分子の揮発性を確認した．その結果，雌ヤギが雄ヤギの被毛に直接接触しなくてもMUAボレーが誘起されたことから，雄効果フェロモンは揮発性分子であることが明らかとなった．また同時に，雄ヤギを去勢するとフェロモンが産生されなくなること⁽²³⁾23) E. Iwata, Y. Wakabayashi, Y. Kakuma, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Biol. Reprod., 62, 806 (2000).や，雄ヤギの頭頚部被毛はフェロモンを含むが臀部の被毛は含まないこと，雄ヤギの被毛を1秒間呈示するだけでもMUAボレーを誘起するには十分であること⁽²⁴⁾24) K. Murata, Y. Wakabayashi, K. Sakamoto, T. Tanaka, Y. Takeuchi, Y. Mori & H. Okamura: J. Reprod. Dev., 57, 197 (2011).などが判明した．

そこで，幅広い揮発性物質を回収できる吸着剤（Tenax）を皮膚から数cm離して維持しておくことのできる帽子を開発し，それを雄ヤギに1週間かぶせておくことで，頭部の皮膚より放出される揮発性物質だけを吸着剤に捕捉した．この吸着剤の内容物から，特に揮発性の高い化学物質が数多く含まれると考えられる1画分を抽出し雌ヤギに呈示したところMUAボレーが誘起されたことから，この画分にフェロモン分子が含まれていることが明らかとなった．筆者らの先行研究により雄ヤギ被毛に含まれる酸性の物質と中性の物質がMUAボレーを誘起することが明らかとなっており，また酸性の物質に着目したほかの研究グループによる先行研究ではフェロモン分子の同定には至らなかったことから，MUAボレーを誘起した画分に含まれる中性の物質に着目することとした．その結果，エチル基をもつアルデヒドやケトン，ジケトンなど18物質が画分のなかから同定された．次にこの18物質を化学合成し，雄ヤギの被毛に含まれる含有率を模して混ぜ合わせたカクテルを作製して雌ヤギに呈示したところ，MUAボレーが誘起されたこと（図3B図3■MUAボレーを指標とした雄効果フェロモンの同定）から，フェロモン分子をこの18物質に絞り込むことができた．また，雄ヤギを去勢するとフェロモンが産生されなくなることが明らかとなっていることから，18物質のうち去勢ヤギではその放出量が少なくなる物質に着目したところ，エチル基をもつ7物質へと候補分子を絞り込むことができた．この7物質がそれぞれ単独でMUAボレーを誘起する効果をもつかを検討した結果，4-ethyloctanalただ一つのみがMUAボレーを誘起することや，また18物質から4-ethyloctanalを除くとMUAボレーを誘起する効力が低下することなどが明らかとなった．これらの結果より，4-ethyloctanalが雄効果フェロモンの主要分子であることが示唆された⁽¹⁸⁾18) K. Murata, S. Tamogami, M. Itou, Y. Ohkubo, Y. Wakabayashi, H. Watanabe, H. Okamura, Y. Takeuchi & Y. Mori: Curr. Biol., 24, 681 (2014).．図4図4■雄効果フェロモンの想定神経回路にはこれまでの研究より推察される雄効果フェロモンの受容・神経機構を示した．

図4■雄効果フェロモンの想定神経回路

こうした神経機構は哺乳類を通じて普遍性が高いと考えられるので，今後の成果が期待される．

1. ラットの不安を増大するフェロモン

ストレスを受けた動物は特別な嗅覚シグナルを放出することは魚類において初めて発見され，その後マウス，ラット，シカ，ウシ，ブタやヒトといった幅広い哺乳類においても確認されていることから，このような嗅覚シグナルは哺乳類にとって重要なシグナルと考えられる．そこで筆者らはラットをモデルとし，まずはストレスに関連する嗅覚シグナルの存在を確認することから開始した．

電気ショックを負荷できる実験箱を用意し，そこに嗅覚シグナルを放出させるために雄ラットを2頭導入した．このようなラットを，以後はドナーと呼ぶこととする．実験箱内でドナーに電気ショックを負荷するため，この実験箱内にはストレスに関連する嗅覚シグナルが充満すると考えられる．電気ショック後ドナーを取り出し，実験箱を異なる部屋へと運んだ後，新たに別の雄ラットを導入した．このように，被験動物としてドナーから放出された嗅覚シグナルに暴露される雄ラットを，以後はレシピエントと呼ぶこととする．レシピエントにとって実験箱は新奇環境であるため，導入されるとストレス反応の一つとして一過性の体温上昇を示すが，事前にドナーが電気ショックを受けた実験箱に導入された場合には，この反応が増強されることが明らかとなった．そのため，ドナーは電気ショックを受けると特別な嗅覚シグナルを放出し，それはレシピエントの自律機能反応を増強することが明らかとなった⁽²⁵⁾25) Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Horm. Behav., 45, 122 (2004).（図5A図5■ストレスに関連する嗅覚シグナルに関する解析）．

図5■ストレスに関連する嗅覚シグナルに関する解析

A：事前にドナーが電気ショック受けた実験箱に導入されたレシピエントは，体温上昇反応の増強を示した．B：麻酔下ドナーの肛門周囲部を局部電気刺激することで，レシピエントに同様の反応を引き起こす嗅覚シグナルを放出させることが可能であった．C：この嗅覚シグナルは，水中に捕捉することが可能であった．

レシピエントの自律機能反応を指標として用いて，ストレスに関連する嗅覚シグナルに関する解析を進めた結果，麻酔下ドナーの肛門周囲部の皮下に刺した2本の針を通じて局部電気刺激を行い人工的に筋肉の収縮を引き起こすことで，肛門周囲腺からストレスに関連する嗅覚シグナルを自在に放出させられることが明らかとなった⁽²⁶⁾26) Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Chem. Senses, 29, 35 (2004).（図5B図5■ストレスに関連する嗅覚シグナルに関する解析）．またこの嗅覚シグナルを水のなかに捕捉する方法も確立した⁽²⁷⁾27) Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Chem. Senses, 30, 513 (2005).（図5C図5■ストレスに関連する嗅覚シグナルに関する解析）．この嗅覚シグナル含有水を用いて，その効果をさまざまな実験系において検討した結果，ストレスに関連する嗅覚シグナルは直接的に自律機能反応を増強するのではなく，レシピエントの不安を増大させることで，実験系に応じたさまざまな反応を誘発することが明らかとなった^(28～31)28) T. Kobayashi, Y. Kiyokawa, Y. Takeuchi & Y. Mori: Chem. Senses, 36, 623 (2011).29) H. Inagaki, Y. Kiyokawa, Y. Takeuchi & Y. Mori: Pharmacol. Biochem. Behav., 94, 575 (2010).30) H. Inagaki, Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Physiol. Behav., 93, 606 (2008).31) Y. Kiyokawa, M. Shimozuru, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Physiol. Behav., 87, 383 (2006).．すなわち，これまで観察された自律機能反応の増強は，不安の増大による二次的な反応の一つであることが判明した．そのためストレスに関連する嗅覚シグナルには，レシピエントの不安を増大するフェロモンが含まれていることが推察された．

2. フェロモン分子の同定

レシピエントがフェロモンに対して示す反応のなかで，最も簡便に測定可能な反応である聴覚性驚愕反射の増強を，生物検定の指標として用いることとした⁽³⁰⁾30) H. Inagaki, Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Physiol. Behav., 93, 606 (2008).．動物は突然大きな音を聞くと，全身の筋肉が硬直して飛び上がる驚愕反射を示すが，この反射の強度は動物の不安と関連していることが知られている．すなわち，不安が増大すると驚愕反射の強度が増すのである（図6A図6■不安を増大するフェロモンの同定）．

図6■不安を増大するフェロモンの同定

A：聴覚性驚愕反射の増強を生物検定系の指標として用いた．B：ストレスに関連する嗅覚シグナルを画分1，画分2，画分3に分画したところ，画分1のみが聴覚性驚愕反射を増強した．C：画分1をさらに画分1-1と画分1-2の2つに分画したところ，画分1-1のみが聴覚性驚愕反射を増強した．D：画分1-1の拡大図と，その抽出イオンクロマトグラム．

フェロモン分子の同定に向けてまず，フェロモン分子の揮発性を検討した．その結果，レシピエントは嗅覚シグナル含有水に直接接触しなくても驚愕反射の増強を示したことから，フェロモンは揮発性であることが確認された⁽³²⁾32) H. Inagaki, K. Nakamura, Y. Kiyokawa, T. Kikusui, Y. Takeuchi & Y. Mori: Physiol. Behav., 96, 749 (2009).．そこで麻酔下ドナーの肛門周囲部から放出させた揮発性物質を吸着剤（Tenax）が充填されたガラス管に吸い込むことで捕捉し，吸着剤の内容物を画分1，画分2，画分3の3つに分画した．その結果，画分1のみが聴覚性驚愕反射を増強したことから，この画分にフェロモン分子が含まれていることが判明した（図6B図6■不安を増大するフェロモンの同定）．画分1をさらに画分1-1と画分1-2の2つに分画したところ，画分1-1のみが聴覚性驚愕反射を増強したため，この画分にフェロモン分子が含まれていることが明らかとなった（図6C図6■不安を増大するフェロモンの同定）．この画分1-1に含まれる物質を精査したところ，フェロモンが存在するサンプルには4-methylpentanalが存在し，hexanalの含有量が増加することが明らかとなったため，この2つの物質がフェロモン分子の有力候補と考えられた（図6D図6■不安を増大するフェロモンの同定）．

次に，化学合成された2つの物質を用いて，これらがフェロモン分子であるかということについて検討した．その結果，それぞれの物質を単独で呈示した場合には驚愕反射を増強しないものの，2物質を混合物として呈示した場合には驚愕反射を増強することが判明した．また，この2種混合物は非常に微量で効果を発揮することや，ストレスに関連する嗅覚シグナルと同じタイプの不安を増大することが薬理学的研究により明らかとなった．さらにこの2種混合物は，聴覚性驚愕反射とは異なる試験においても不安の増大を示唆する反応を引き起こすことが確認されたことから，4-methylpentanalとhexanalの2種混合物がフェロモン分子であることが明らかとなった⁽¹³⁾13) H. Inagaki, Y. Kiyokawa, S. Tamogami, H. Watanabe, Y. Takeuchi & Y. Mori: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111, 18751 (2014).．図7図7■不安を増大するフェロモンの想定神経回路にはこれまでの研究より推察される，ラットの不安を増大するフェロモンの受容・神経機構を示した．

図7■不安を増大するフェロモンの想定神経回路

主嗅覚系と鋤鼻系にてそれぞれ受容された情報が脳内で統合され，不安が増大される．