1. レアアースに依存したメタノール生育を示すMethylobacterium属細菌の発見

私たちのグループではレアアースと微生物のかかわりを探るべく，貧栄養培地上でレアアースにより生育が著しく賦活化される微生物のスクリーニングを試みたところ，サマリウム（Sm）とユウロピウム（Eu）でコロニー径が大きくなるピンク色のコロニーを見いだした⁽⁶⁾6) 日比慶久，奥田雅代，佐久間隆介，岩間智徳，河合啓一：環境技術，40, 108 (2011).（図2図2■レアアース（Sm）により生育が賦活化されるMethylobacterium sp. MAFF211642株）．このピンク色のコロニーを形成するEU-1株（MAFF211642株）は，16S rRNA遺伝子配列がMethylobacterium radiotolerans基準株と98%以上の相同性を示し，その生理・生化学的性状からもMethylobacterium sp.と同定された⁽⁶⁾6) 日比慶久，奥田雅代，佐久間隆介，岩間智徳，河合啓一：環境技術，40, 108 (2011).．

図2■レアアース（Sm）により生育が賦活化されるMethylobacterium sp. MAFF211642株

貧栄養培地（1/100普通寒天培地）上でのMAFF211642株のコロニーの形態．培地にSmを添加することでMAFF211642株のコロニー径は大きくなる．

Methylobacterium属細菌は，塩素消毒された水道水からも高頻度に単離される貧栄養細菌として知られるが⁽⁷⁾7) A. Hiraishi, K. Furuhata, A. Matsumoto, K. A. Koike, M. Fukuyama & K. Tabuchi: Appl. Environ. Microbiol., 61, 2099 (1995).，その名のとおりメタノールを唯一の炭素源として生育できるメチロトローフ細菌であり，生態系では植物葉上で放出されるメタノールを資化し⁽⁸⁾8) D. Abanda-Nkpwatt, M. Musch, J. Tschiersch, M. Boettner & W. Schwab: J. Exp. Bot., 57, 4025 (2006).，植物にホルモン様物質などを供給するという生態が理解されつつあり^(9,10)9) M. Madhaiyan, B. V. Suresh Reddy, R. Anandham, M. Senthilkumar, S. Poonguzhali, S. P. Sundaram & T. Sa: Curr. Microbiol., 53, 270 (2006).10) M. Senthilkumar, M. Madhaiyan, S. Sundaram & S. Kannaiyan: Microbiol. Res., 164, 92 (2009).，近年，注目を集めている植物共生細菌の一種である⁽¹¹⁾11) J. A. Vorholt: Nat. Rev. Microbiol., 10, 828 (2012).．そこで，Methylobacterium属細菌のモデル株であるM. extorquens AM1株を用いてメタノール生育におけるレアアース要求性を観察したところ，メタノール生育の必須因子とされていたカルシウム（Ca）を培地中から取り除くとAM1株はメタノール生育をほとんど示さないことが知られているが，Caの代わりにLaを培地中に添加すると良好なメタノール生育を示した⁽¹²⁾12) T. Nakagawa, R. Mitsui, A. Tani, K. Sasa, S. Tashiro, T. Iwama, T. Hayakawa & K. Kawai: PLoS ONE, 7, e50480 (2012).（図3A図3■M. extorquens AM1野生株およびΔmxaF株のメタノール生育⁽¹²⁾）．つまり，AM1株もMAFF211642株同様にレアアースに依存的なメタノール生育能力をもち，レアアースがメタノール代謝においてCaと同等，もしくはそれ以上の役割をもつ必須因子である可能性が初めて示された．

図3■M. extorquens AM1野生株およびΔmxaF株のメタノール生育⁽¹²⁾

（A）AM1野生株はメタノール／Ca培地（○）でもメタノール／La培地（●）でも同等の生育を示す．一方，（B）ΔmxaF株はメタノール／Ca培地（○）では全く生育できないが，メタノール／La培地（●）にはごく普通に生育できる．つまり，レアアース依存的メタノール生育にはMxaFは関与しないことがわかる．

1. レアアース依存的なメタノール生育に必要なメタノール脱水素酵素はXoxF1である

Methylobacterium属細菌のメタノール生育で，レアアースはどのような役割を果たしているのだろうか？　M. extorquens AM1株が軽希土類元素に特異的なメタノール生育を示したので，軽希土類元素LaによるAM1株のメタノール代謝酵素群の発現誘導を観察したところ，メタノール脱水素酵素（MDH）がLaにより強力に誘導された⁽¹²⁾12) T. Nakagawa, R. Mitsui, A. Tani, K. Sasa, S. Tashiro, T. Iwama, T. Hayakawa & K. Kawai: PLoS ONE, 7, e50480 (2012).．レアアースによるMDH活性の誘導はMethylobacterium sp.やM. radiotoleransでも同様に観察され^(6,13)6) 日比慶久，奥田雅代，佐久間隆介，岩間智徳，河合啓一：環境技術，40, 108 (2011).13) Y. Hibi, K. Asai, H. Arafuka, M. Hamajima, T. Iwama & K. Kawai: J. Biosci. Bioeng., 111, 547 (2011).，このことはMDHがレアアース依存的メタノール代謝の鍵を握る因子であることを容易に連想させた．そこで，メタノール／Ca培地とメタノール／La培地で生育させたAM1株からそれぞれMDHを精製し，両MDH（Ca-MDHおよびLa-MDH）の比較を行った．その結果，Ca-MDHはこれまで報告されているとおりmxaオペロンにコードされているαサブユニット（MxaF）とβサブユニット（MxaI）からなるヘテロ四量体のMxaFIであったのに対し⁽¹⁴⁾14) D. Y. Nunn, D. Day & C. Anthony: Biochem. J., 260, 857 (1989).，驚いたことにLa-MDHはこれまで機能未知とされていたxoxF1にコードされているタンパク質で，βサブユニットをもたなかった⁽¹²⁾12) T. Nakagawa, R. Mitsui, A. Tani, K. Sasa, S. Tashiro, T. Iwama, T. Hayakawa & K. Kawai: PLoS ONE, 7, e50480 (2012).．またLa-MDHであるXoxF1は，MxaFIと比較しても十分なMDH活性をもち，予想どおりPQQを補欠分子族とし，これまで報告例のないLaを補因子とする新規な酵素であった⁽¹²⁾12) T. Nakagawa, R. Mitsui, A. Tani, K. Sasa, S. Tashiro, T. Iwama, T. Hayakawa & K. Kawai: PLoS ONE, 7, e50480 (2012).．

これまでXoxF1は，アミノ酸レベルでMxaFと約50%と高い相同性を示すものの，CaではMDH活性を示さないこと⁽¹⁵⁾15) S. Schmidt, P. Christen, P. Kiefer & J. A. Vorholt: Microbiology, 156, 2575 (2010).，その遺伝子欠損株はメタノール／Ca培地に生育できることなどから⁽¹⁶⁾16) L. Chistoserdova & M. E. Lidstrom: Microbiology, 143, 1729 (1997).，xoxF2とともにmxaFの機能未知のパラログ遺伝子として考えられてきた．しかし，近年，XoxF1が植物葉上や根圏で主要な微生物由来タンパク質として検出されること^(11,17,18)11) J. A. Vorholt: Nat. Rev. Microbiol., 10, 828 (2012).17) N. Delmotte, C. Knief, S. Chaffron, G. Innerebner, B. Roschitzki, R. Schlapbach, C. von Mering & J. A. Vorholt: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 16428 (2009).18) S. M. Sowell, P. E. Abraham, M. Shah, N. C. Verberkmoes, D. P. Smith, D. F. Barofsky & S. J. Giovannoni: ISME J., 5, 856 (2011).，xoxF1とxoxF2がともに欠損するとAM1株はメタノール生育を示さなくなることなど⁽¹⁹⁾19) E. Skovran, A. D. Palmer, A. M. Rountree, N. M. Good & M. E. Lidstrom: J. Bacteriol., 193, 6032 (2011).，XoxF1は単なる重複遺伝子ではなく，何らかの重要な機能をもつことが推測され始め，その機能に関してはさまざまな仮説が挙げられていたものの，その核心を突くものはなかった．そのようななか，レアアース存在下でXoxF1がMDH活性を示したことから，XoxF1の主要な機能はレアアース依存型MDHであることが初めて明らかとなったのである．

前述のとおり，AM1株はmxaFとxoxF1，xoxF2の3コピーのMDHパラログ遺伝子をもつが（図4図4■M. extorquens AM1株のMDHをコードする遺伝子とMDHの構成），それぞれのMDH遺伝子欠損株のうち，Ca-MDHをコードするmxaFの欠損株ΔmxaFはメタノール／Ca培地には生育できないが，メタノール／La培地に野生株と同等の生育を示す⁽¹²⁾12) T. Nakagawa, R. Mitsui, A. Tani, K. Sasa, S. Tashiro, T. Iwama, T. Hayakawa & K. Kawai: PLoS ONE, 7, e50480 (2012).（図3B図3■M. extorquens AM1野生株およびΔmxaF株のメタノール生育⁽¹²⁾）．一方，ΔxoxF1株はメタノール／La培地にほとんど生育することができない（未発表データ）．このことから，MxaFIはLa依存的メタノール代謝には一切関与しておらず，La依存的なメタノール生育に必要なMDHはXoxF1であることが示され，XoxF1がメタノール代謝において重要な機能タンパク質であることが証明された．

図4■M. extorquens AM1株のMDHをコードする遺伝子とMDHの構成

Ca-MDHはαサブユニット（MxaF: 緑色）とβサブユニット（MxaI: 灰色）からなるヘテロ四量体で，これらをコードするmxaオペロンは，mxaFとmxaI，Ca-MDHの電子受容体であるシトクロムc_LをコードするmxaGなどCa-MDHの活性発現に関与する遺伝子群で構成されている．一方，La-MDHをコードするxox1オペロンは，αサブユニット（緑色）のxoxF1とシトクロムcをコードするxoxGおよびmxaJのパラログ遺伝子のみからなる小さなオペロンである．一方，xoxF2はオペロン構造をもたず，その遺伝子産物の構造・機能は不明である．

2. レアアース依存型メタノール脱水素酵素はさまざまな微生物群に広く分布する

新規レアアース依存型MDHであるXoxF1だが，レアアース依存型MDHは果たしてM. extorquens AM1株のみがもつユニークな酵素なのであろうか？　答えは，「ノー」であり，M. radiotolerans NBRC15690株から精製されたLa-MDHもまた，mxaFではなくxoxFにコードされていることが証明されている⁽¹³⁾13) Y. Hibi, K. Asai, H. Arafuka, M. Hamajima, T. Iwama & K. Kawai: J. Biosci. Bioeng., 111, 547 (2011).．また，XoxF1と高い相同性をもつMDH遺伝子はMethylobacterium属細菌の公開されているほとんどのゲノム配列上で確認できること（図5図5■Methylobacterium属細菌およびさまざまな細菌由来のXoxFの系統樹），また私たちが自然界から単離したほとんどすべてのMethylobacterium属細菌がxoxF遺伝子をもつことから（未発表データ），レアアース依存型MDHはMethylobacterium属細菌に広く分布することは間違いない事実である．

図5■Methylobacterium属細菌およびさまざまな細菌由来のXoxFの系統樹

XoxF1と高い相同性を示す遺伝子は，Methylobacterium属細菌（薄灰色box）のみならず，根粒菌（濃灰色box）をはじめとしたさまざまな細菌に広く分布するが，それらは分子系統上，MxaF（Ca-MDH）とは異なるグループを形成する．

一方，ゲノム情報からXoxF1と高い相同性をもつMDH遺伝子はMethylobacterium属細菌以外にも，ほかのメチロトローフ細菌のMethylotenera mobilis^(20,21)20) G. Bosch, T. Wang, E. Latypova, M. G. Kalyuzhnaya, M. Hackett & L. Chistoserdova: Microbiology, 155, 1103 (2009).21) A. Lapidus, A. Clum, K. Labutti, M. G. Kaluzhnaya, S. Lim, D. A. Beck, T. Glavina Del Rio, M. Nolan, K. Mavromatis, M. Huntemann et al.: J. Bacteriol., 193, 375 (2011).，Bradyrhizobium属^(22,23)22) T. Kaneko, Y. Nakamura, S. Sato, K. Minamisawa, T. Uchiumi, S. Sasamoto, A. Watanabe, K. Idesawa, M. Iriguchi, K. Kawashima et al.: DNA Res., 9, 189 (2002).23) N. Sudtachat, N. Ito, M. Itakura, S. Masuda, S. Eda, H. Mitsui, Y. Kawaharada & K. Minamisawa: Appl. Environ. Microbiol., 75, 5012 (2009).やRhizobium属，Sinorhizobium属，Azorhizobium属などの根粒菌，メタン酸化細菌であるMethylacidiphilum fumariolicum^(24,25)24) A. Pol, K. Heijmans, H. R. Harhangi, D. Tedesco, M. S. Jetten & H. J. Op den Camp: Nature, 450, 874 (2007).25) A. F. Khadem, A. S. Wieczorek, A. Pol, S. Vuilleumier, H. R. Harhangi, P. F. Dunfield, M. G. Kalyuzhnaya, J. C. Murrell, K. J. Francoijs, H. G. Stunnenberg et al.: J. Bacteriol., 194, 3729 (2012).，光合成細菌であるRhodobacter sphaeroides⁽²⁶⁾26) C. Mackenzie, M. Choudhary, F. W. Larimer, P. F. Predki, S. Stilwagen, J. P. Armitage, R. D. Barber, T. J. Donohue, J. P. Hosler, J. E. Newman et al.: Photosynth. Res., 70, 19 (2001).などさまざまな細菌がXoxFのオーソログ遺伝子をもっていることが知られている⁽²⁷⁾27) J. T. Keltjens, A. Pol, J. Reimann & H. J. M. Op den Camp: Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 6163 (2014).（図5図5■Methylobacterium属細菌およびさまざまな細菌由来のXoxFの系統樹）．特にBradyrhizobium sp. MAFF211645株とMethylacidiphilum fumariolicum SolV株由来XoxFは精製され，両酵素ともにレアース依存型MDHであることがすでに報告されている^(28,29)28) N. A. Fitriyanto, M. Fushimi, M. Matsunaga, A. Pertiwiningrum, T. Iwama & K. Kawai: J. Biosci. Bioeng., 111, 613 (2011).29) A. Pol, T. R. Barends, A. Dietl, A. F. Khade, J. Eygensteyn, M. S. Jetten & H. J. Op den Camp: Environ. Microbiol., 16, 255 (2014).．さらにSolV株由来XoxFはその分子立体構造も提示され，Laを中心とした活性中心の構造も明らかになっている^(29,30)29) A. Pol, T. R. Barends, A. Dietl, A. F. Khade, J. Eygensteyn, M. S. Jetten & H. J. Op den Camp: Environ. Microbiol., 16, 255 (2014).30) J. A. Bogart, A. J. Lewis & E. J. Schelter: Chemistry, 21, 1743 (2015).．このようにレアアース依存型MDHは，Methylobacterium属細菌のみならずさまざまな微生物群に広く分布する一般的な酵素であることが徐々に明らかとなってきた．

1. レアアース依存的にメタノールを利用できる微生物は自然界に広く生息する

レアアースに依存的なメタノール生育を示す微生物は自然界にどれくらい生息するのであろうか？　私たちはメタノール／La培地を用いて自然界から集積培養でメチロトローフ細菌をスクリーニングしたところ，ほとんどすべての植物サンプルからLa依存的にメタノール生育を示すMethylobacterium属細菌が獲得でき，なかには従来メタノール生育に必須とされていたCaに依存的なメタノール生育を全く示さず，レアアースのみを要求する株まで存在した（未発表データ）．このことは，レアアースを必須因子として利用するメタノール代謝系をもつMethylobacterium属細菌が自然界に普遍的に存在し，これら微生物達は私たちが常識と考えていたCaよりもレアアースを優先的に利用する，またはそれに依存しているということになる．

また，先述のレアアース依存型MDHのXoxFをもつメタン酸化菌Methylacidiphilum fumariolicumはMethylobacterium属細菌同様，レアアース依存的なメタン生育を示すことが報告されているが⁽²⁹⁾29) A. Pol, T. R. Barends, A. Dietl, A. F. Khade, J. Eygensteyn, M. S. Jetten & H. J. Op den Camp: Environ. Microbiol., 16, 255 (2014).，メチロトローフとしての報告がない根粒菌Bradyrhizobium属細菌さえもレアアースを加えることでメタノール生育を示す（未発表データ）．面白いことに，これら菌株はCa依存型MDHをコードするmxaFIのオーソログ遺伝子をもたず，レアアース存在下でのみメタノール生育を示す．このことは，これまでメチロトローフとしての報告がない細菌群でもレアアース依存的メタノール代謝系をもっている可能性を示しており，レアアース依存的なメチロトローフ細菌が自然界に広く分布する可能性を示している．

2. 自然界におけるレアアース依存的メタノール代謝系の役割

では，何故これら微生物群がレアアース依存的メタノール生育能力をもつ必要があるのだろうか？　これまで見いだされているレアアース依存的なメタノール代謝を示す微生物群はMethylobacterium属細菌や根粒菌のBradyrhizobium属細菌など，植物との共生が知られている細菌群がほとんどである．また，植物は成長の過程において大量のメタノールを生産し，体外に放出していることが知られている⁽³¹⁾31) M. Nemecek-Marshall, R. C. MacDonald, J. J. Franzen, C. L. Wojciechowski & R. Fall: Plant Physiol., 108, 1359 (1995).．さらに，植物根圏には十分なレアアースが存在し⁽³²⁾32) G. Tyler & T. Olsson: Biol. Trace Elem. Res., 106, 177 (2005).，植物がレアアースを根から積極的に吸収し，根のみならず，茎，葉上にまでレアアースを輸送・蓄積していることが報告されている^(2,33)2) G. Tyler: Plant Soil, 267, 191 (2004).33) X. Guo, Q. Zhou, T. Lu, M. Fang & X. Huang: Ann. Bot. (Lond.), 100, 1459 (2007).．つまり，これら微生物群は葉上や根圏で植物と共生することで常にレアアース依存的メタノール代謝を行える環境下に身を置くことができ，レアアースを利用することで植物の生育や代謝を邪魔することなく，メタノールに生育できることが想像できる．また，これら植物共生細菌群は植物の成長促進を促すことから，報告されている適正濃度のレアアースによる植物成長促進作用^(4,5)4) D. Liu, X. Wang, X. Zhang & Z. Gao: Plant Soil Environ., 59, 196 (2013).5) Z. Hu, H. Richter, G. Sparovek & E. Schnug: J. Plant Nutr., 27, 183 (2004).もこれら植物共生細菌群の活性化が要因となっているとの仮説も立てることができる（図6図6■植物共生細菌のレアアース依存的メタノール代謝と植物との共生関係）．これらはあくまでも仮説の段階を抜け出せないが，今後，レアアースが微生物と植物の共生関係の鍵を握る因子としての役割を証明できればと考えている．

図6■植物共生細菌のレアアース依存的メタノール代謝と植物との共生関係

メチロトローフ細菌は植物が放出するメタノールをレアアース依存的に資化し，植物ホルモン様物質を供給することで共生関係を結んでいると考えられる．一方，根粒菌も窒素固定と引き換えに，根から放出されるメタノールをレアアース依存的に利用していることが想像できるが，そのメタノール代謝経路の詳細と役割については不明である．現在，根粒菌のメタノール代謝経路について，ゲノム情報などからの解析を進めている．