微生物機能を利用した医薬・化学品製造は社会に多くの恩恵をもたらしてきた．大村北里大学特別栄誉教授のノーベル賞受賞により探索から始まる微生物応用の重要性が世界に発信されるとともに，今後取るべき道への模索がますます注目されることとなった．微生物産業の当事者視点からこれまでの企業活動を振り返り，今後の本分野の発展と社会貢献のためのあり方を考えてみたい．

はじめに

2015年のノーベル生理学・医学賞は，寄生虫による感染症に対する新しい治療法の発見に対し，大村　智先生（北里大学特別栄誉教授）とウィリアム・キャンベル博士（ドリュー大学名誉研究フェロー）に贈られた．微生物の機能を活用し社会に役立てる使命をもつ筆者らにとってもこの受賞は大きな喜びと励ましをいただく機会となった．本受賞を心から祝福したい．

大村先生のご受賞で思いを新たにしたことは，環境中に無尽蔵に生息する極めて小さな生命体が多くの人々に多大な恩恵をもたらすこと，そしてその基点となる探索研究の重要性である．本記事では微生物を産業利用してきた一企業，日本マイクロバイオファーマ株式会社（以下，「当社」）が微生物にどのような取り組みをしてきたか振り返ってみる．

当社の発酵生産

当社は，メルシャン株式会社の医薬・化学品部門を承継して2011年7月に設立された新しい会社で，医薬品，動物薬，農薬，食品添加物の原体または中間体などを発酵法，微生物変換法，合成法を単独または組み合わせた工程で製造している．前身の会社からの発酵事業を振り返ると，1941年アセトン・ブタノール発酵の工業化から始まる70年以上もの歴史がある．それ以降，1948年ペニシリン（発酵），1960年アミノ酸（発酵），1966年アミノグリコシド系農業用抗生物質「カスガマイシン」（発酵），1969年マクロライド系ヒト用抗生物質（発酵），1979年食品添加物「シクロデキストリン」（酵素変換），1981年アントラサイクリン系制がん剤「アクラルビシン」（発酵），1990年食品添加物「ポリリジン」（発酵），1994年活性型ビタミンD₃「カルシトリオール」（微生物変換），1999年マクロライド系免疫抑制剤（発酵）を製造してきた（カッコ内は製造プロセス要件）．これらの製造のために利用された株は，始めは探索研究で見いだされた生産性の極めて低い野生株であったが，化学変異剤やUV処理後のスクリーニングを繰り返し，製造に望ましい生産能力を獲得した変異株を選択することで工業生産を実現してきた．

このような事業活動のなか，1980年代後半，当社ではマクロライド系動物用抗生物質タイロシン誘導体の中から，タイロシンより活性が高く，タイロシン耐性菌にも効果を有する化合物の探索研究をしていた．その過程で，構造類似のアシル化マクロライド化合物を作る放線菌Streptomyces thermotolerans変異株の培養液中にタイロシンを投入するとアシル化されたタイロシンの一種，アイブロシン（3-O-acetyl-4″-O-isovaleryltylosin）が生産され，これが優れた抗菌活性を示した（図1図1■タイロシンおよびアイブロシンの構造）．微生物変換での製造研究を進める一方で，S. thermotoleransからアシル基転移酵素遺伝子をクローニングし，タイロシン生産株S. fradiaeへ組換えることで，直接アイブロシンを発酵生産する菌株を構築できた⁽¹⁾1) A. Arisawa, N. Kawamura, T. Narita, I. Kojima, K. Okamura, H. Tsunekawa, T. Yoshioka & R. Okamoto: J. Antibiot., 49, 349 (1996).．これが当社育種研究における組換え技術の最初の応用例となった．

図1■タイロシンおよびアイブロシンの構造

一方で，抗がん活性物質ダウノルビシンは菌改良による生産性向上とプロセス開発を経て，1986年商業製造を開始した．発酵産物そのものが最適な薬効をもつことは限られている．そこで，発酵産物にさらに化学修飾を施し，目的に適った半合成医薬品の製造も目指した．発酵で製造されたダウノルビシンは合成工程を経て1986年ピラルビシン（先発品），1997年ドキソルビシン（後発品），2007年エピルビシン（後発品）として順次製造，承認を取得し，アンスラサイクリン系抗がん剤のラインアップを拡充した．今後，高品質で安価なアンスラサイクリン系抗がん剤原薬で世界一を目指している（図2図2■半合成アンスラサイクリン）．

図2■半合成アンスラサイクリン

発酵で製造したダウノルビシンを原料に3種のアンスラサイクリン系抗がん剤が合成される．

創薬資源としての微生物の利用

1. 微生物創薬支援

微生物が作り出す天然物は人知を超えた構造多様性に富み，さらに生体親和性が高いことで医薬品，動物薬，農薬の探索資源として利用されてきた．抗生物質，抗がん剤，酵素阻害剤，免疫抑制剤，酵素などの探索源としての価値は今も維持されている．

1950年代より盛んに微生物の分離，スクリーニングが行われるなか，当社においても1960年代から，土壌などより分離した微生物の中から産業上重要な発酵産物，たとえば優れた抗菌作用，抗腫瘍作用を有する化合物を生産する微生物の選択に努めてきた．その中で，1978年には，日本では初めて強い抗菌作用・広い抗菌スペクトルをもつカルバペネム系抗生物質PS-5を⁽²⁾2) K. Okamura, S. Hirata, Y. Okumura, Y. Fukagawa, Y. Shimauchi, K. Kouno, T. Ishikura & J. Lei: J. Antibiot., 31, 480 (1978).，1988年には，アントラサイクリン系抗生物質の中でも細胞毒性が極めて強いベタクラマイシン⁽³⁾3) A. Yoshimoto, S. Fujii, O. Johdo, K. Kubo, T. Ishikura, H. Naganawa, T. Sawa, T. Takeuchi & H. Umezawa: J. Antibiot., 39, 902 (1986).をはじめ，多くの化合物を見いだしてきた（図3図3■PS-5およびベタクラマイシンTの構造）．後者の化合物群は近年開発が進むさまざまな抗体薬物複合体（Antibody-Drug Conjugate）への活用に期待している⁽⁴⁾4) 大内　香：Drug Delivery System, 28, 424 (2013).．1990年代からは，微生物資源を保有しない製薬企業やアカデミアと微生物創薬に関する共同研究を開始し，現在では放線菌2万株，糸状菌（カビ）2万株の菌株ライブラリーを有し，長年の経験から培った微生物分離・培養技術と，最新のインフォマティックスを組み合わせることで創薬シードの化合物となりうる多様な微生物資源（菌株，抽出物，精製化合物）を提供している．

図3■PS-5およびベタクラマイシンTの構造

1993年に発効された「生物多様性条約」により，生物多様性に富む国々の生物資源へのアクセスが困難になっていた中で，2004年からは，アジアで有数の豊富な生物多様性を有するインドネシアの技術評価応用庁（BPPT）と連携して同国の生物資源を提携した製薬企業やアカデミアの創薬研究のために提供してきた．現在，独立行政法人国際協力機構（JICA）と国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）が連携して実施している地球規模課題対応国際科学技術協力プログラム（SATREPS）「インドネシアの生物資源多様性を利用した抗マラリア・抗アメーバ新規薬剤リード化合物の探索」を筑波大学，東京大学，北里大学と共同で推進している⁽⁵⁾5) SATREPS: http://www.jst.go.jp/global/kadai/h2609_indonesia.html．

現在当社では，微生物の多様性を調べるために，個々の菌株のリボソームRNA配列情報に加えて，生産物解析結果，抗菌アッセイ結果，文献情報などを統合した独自のデータベースを作成し，効率的な創薬研究に取り組んでいる．数に頼って闇雲にスクリーニングを繰り返していた前時代の問題点を克服し，天然物利用の機運も追い風となるなか，本データベースを活用した微生物創薬の加速と成果創出に期待を寄せている．

2. シトクロムP450ライブラリー

微生物は化合物の探索源のみならず酵素の探索源としても貴重である．当社では創薬支援の一環で，モノオキシゲナーゼの一種であるシトクロムP450に着目し，医薬候補になるさまざまな化合物の水酸化変換を目的として探索基盤を確立した⁽⁶⁾6) A. Arisawa & H. Agematu: “Modern Biooxidation Enzymes, Reactions and Applications: A modular approach to biotransformation using microbial cytochrome P450 monooxygenases,” ed. by R. D. Schmid, John Wiley & Sons, 2007.．

P450による水酸化は，後述の微生物変換によるカルシトリオール生産のように，化学合成では困難な位置特異的，立体選択的な水酸基導入を可能にするケースがあると同時に，医薬化合物候補の薬物動態や活性を向上させることがあり，製造プロセスと物性の両面で課題解決の提案が可能である．さらに，新たに導入した水酸基を基点に新規な誘導体を合成でき，新規な化合物ライブラリーの拡充に有効でもある．特に放線菌は多様なP450酵素の宝庫である．1菌株のゲノムに20～30種存在するP450遺伝子を発現ベクターに組み込み，機能的に大腸菌で発現させることで，マルチウェルプレート上で迅速に水酸化変換スクリーニングが可能なプラットフォームを構築し，創薬支援への強力なツールとして活用している．

3. プラジエノライド

プラジエノライドB（pladienolide B; PLD-B）は，当社が提供した放線菌Streptomyces platensis Mer-11107の培養液抽出物を使った共同研究先のアッセイにより見いだされた抗腫瘍性物質である⁽⁷⁾7) T. Sakai, T. Sameshima, M. Matsufuji, N. Kawamura, K. Dobashi & Y. Mizui: J. Antibiot., 57, 173 (2004).（図4図4■プラジエノライドの水酸化）．同菌が作る59種の類縁化合物の構造活性相関に基づく評価により，PLD-Bの16位水酸化体であるプラジエノライドD（PLD-D）がより良い性質を示すことがわかった⁽⁸⁾8) 酒井　孝：ファルマシア，47, 669 (2007).．PLD-Dの蓄積量がごく微量であったため，まずPLD-BをPLD-Dに変換する微生物を探索した後，その微生物から本変換反応を触媒する水酸化酵素遺伝子を同定し，S. platensis Mer-11107のゲノム中に組み込むことによりPLD-Dを直接発酵生産できる微生物を創り出した⁽⁹⁾9) K. Machida, Y. Aritoku & T. Tsuchida: J. Biosci. Bioeng., 107, 569 (2009).．その後，菌株改良や培養条件検討により，当初の約1,250倍まで生産性を高めた．結果的に当社が提供する創薬支援サービス（研究初期から製造まで一貫して対応可能）の要素のほとんどを動員して実製造レベルに至った好例となった．本開発物質は，新しい作用点であるスプライスゾームSF3b複合体の阻害活性物質として注目されている⁽¹⁰⁾10) Y. Kotake, K. Sagane, T. Owa, Y. Mimori-Kiyosue, H. Shimizu, M. Uesugi, Y. Ishihama, M. Iwata & Y. Mizui: Nat. Chem. Biol., 3, 570 (2007).．

図4■プラジエノライドの水酸化

放線菌シトクロムP450により，16位が水酸化され，プラジエノライドDが得られる．

微生物変換

1. カルシトリオール（活性型ビタミンD₃）

水酸化の効用について前述したが，ヒトに内在するP450においてはホルモン合成や薬物代謝などの重要な生理的機能をもっている．その一つにビタミンD₃（VD₃）の活性化が挙げられる．VD₃は生体内において，肝臓と腎臓で2段階のP450による水酸化反応によって活性型であるカルシトリオール（1α,25-dihydroxyvitamin D₃）が生成し，Ca代謝調節に関係することが知られ，骨粗鬆症薬や二次性副甲状腺機能亢進症薬として使われている．一般的にはカルシトリオールはコレステロールから約20工程の有機合成法で製造されている．一方，当社ではカルシトリオールを，ヒトP450と同様な水酸化機能をもつ放線菌Pseudonocardia autotrophicaを変換菌として，VD₃から一工程の微生物変換で製造している（図5図5■ビタミンD₃の微生物変換）．当社の発展的研究においては，同菌がもつ変換活性の本体は1α位および25位の水酸化活性を併せ持つP450酵素であることがわかった．加えて，本酵素の反応機構解明や活性向上の側面で成果が得られている^(11,12)11) Y. Fujii, H. Kabumoto, K. Nishimura, T. Fujii, S. Yanai, K. Takeda, N. Tamura, A. Arisawa & T. Tamura: Biochem. Biophys. Res. Commun., 385, 170 (2009).12) Y. Yasutake, Y. Fujii, T. Nishioka, W.-K. Cheon, A. Arisawa & T. Tamura: J. Biol. Chem., 285, 31193 (2010).．

図5■ビタミンD₃の微生物変換

放線菌Pseudonocardia autotrophicaがもつ水酸化酵素（Vdh）により初めに25位，次に1α位が水酸化されカルシトリオールができる．

2. L-ピペコリン酸とヒドロキシ-L-ピペコリン酸

5員環のL-プロリンとヒドロキシL-プロリンは，すでに医薬中間体として製法が確立され市販されているが，6員環のL-ピペコリン酸とヒドロキシL-ピペコリン酸は希少アミノ酸で医薬中間体として注目されているがその効率的な製法は確立されていなかった．当社ではFlavobacterium lutescens由来のリジンアミノ基転移酵素遺伝子およびSegniliparus rugosus由来のジオキシゲナーゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌により基質L-リジンから一工程でL-ピペコリン酸およびcis-5-ヒドロキシ-L-ピペコリン酸（cis-5-hydroxy-L-pipecolinic acid）を製造する効率的な微生物変換プロセスを確立した⁽¹³⁾13) 藤井　匡ほか：シス-5-ヒドロキシピペコリン酸の生物学的な製造方法，国際公開WO2013/187438（図6図6■L-ピペコリン酸およびヒドロキシ-L-ピペコリン酸の生産）．この経路において，最後のジオキシゲナーゼ遺伝子の選択によりtrans-5-水酸化体やcis-3-水酸化体といった価値ある異性体の作り分けが可能である．

図6■L-ピペコリン酸およびヒドロキシ-L-ピペコリン酸の生産

組換え大腸菌で基質とするL-リジンから，2段階の酵素系でL-ピペコリン酸が生成し，その後，さらにジオキシゲナーゼ遺伝子の導入によってヒドロキシ-L-ピペコリン酸が生産される．最終段階のジオキシゲナーゼ遺伝子を選択することにより，3種の異性体の作り分けが可能となる．

従来，自然界から目的の化合物を生産する菌株を探索してきたが，菌株間に分散するさまざまな酵素遺伝子をカスタマイズ（必要に応じて代謝系を変え，機能改変）して組み合わせ，天然には希少な，または作りえない化合物を主産物として生産することが可能となってきた．微生物機能を駆使するこのような能動的な取り組みは今日，合成生物工学の潮流に乗り，バイオプロセス発展を担うと考えている．

展望

植物や海洋生物から有効成分を見いだし，大量生産を行う場合，その生産性においては季節や天候の変動，生産不安定性の影響を免れない．一方，物質生産手段としての微生物は，一度製造法が確立すれば，集約的なスペースで多段階の複雑な工程が1回の培養で完結できるなど多くの利点がある．課題であった育種への労力もゲノム情報，改変ツールなどの活用により改善が進んでいる．将来の微生物生産は，合成生物工学の発展を原動力に，より付加価値の高いもの，微生物以外の生物由来化合物も生合成できる洗練された技術が必要と考える．たとえばヒト由来のタンパク質，植物由来の多様な天然物，ひいては人工的にデザインした非天然化合物でさえも大腸菌や酵母で大量に製造できる技術を目指している⁽¹⁴⁾14) 日本マイクロバイオファーマ：ニュースリリース・お知らせ，http://www.microbiopharm.com/release/2015/アステラス製薬の清須工場の事業の譲受について.pdf．微生物が作り出す天然物は非常に魅力的であるが，一時は合成化合物を対象にしたハイスループット探索研究の流れや抗体医薬などのバイオ医薬品が進展し，微生物創薬から撤退する会社が相次いだ．しかし，現在では生体親和性の高い天然物への回帰の傾向が見られ，特に全合成が困難で，これまで扱い難いとされてきた分子量500以上の天然物（中分子天然物）への期待が高まってきている．これを好機と捉え，微生物の機能を最大限発揮させて産業利用につなげていくことが当社の使命と考える．

大村先生のノーベル賞受賞が微生物の可能性を広げる起爆剤になることを祈願する．