外膜の透過障壁性と多剤排出ポンプ^{(4, 5)}

グラム陰性細菌の外膜は外葉がリポ多糖，内葉がリン脂質で形成される非対称脂質二重層であり，一般的なリン脂質二重層に比べ疎水性物質の透過を著しく阻害する．さらに親水性物質の透過を担う外膜チャネルは分子サイズの大きい化合物（大腸菌の場合，おおよそ分子量＞600）の流入を遮断するため，外膜は疎水性および（比較的高分子量の）親水性物質の流入を効果的に制限できる（図1A図1■グラム陰性細菌に対する薬剤の挙動）．多剤排出ポンプは複数種あるが，大別すると細胞質膜で単独で機能するものと，細胞質膜と外膜にまたがる複合体を形成し薬剤を細胞外へ直接排出するものの2つに分類される．後者の代表がresistance-nodulation-division（RND）superfamilyに属する排出ポンプであり，プロトン駆動力を利用し極めて多様な薬剤を排出でき，多剤耐性への寄与が最も大きい．大腸菌AcrAB-TolCはRNDポンプのプロトタイプとして研究が最も進んでいる．AcrBは細胞質膜に3量体で構成されポンプの主体として機能し，基質（排出される薬剤）をペリプラズムないし細胞質膜内部で認識してプロトン駆動力を利用した排出動作により外膜チャネルTolCに送り込む．AcrAはペリプラズムに局在し，複合体形成とポンプ機能の両方に必須の働きをする（図1A図1■グラム陰性細菌に対する薬剤の挙動）．

β-Lactamsの外膜透過・排出速度の測定

AcrAB-TolCに関しては大腸菌の多剤耐性の主要因となることが1990年代に明らかにされて以来活発な研究が続けられ，1999年には精製AcrBをリポソームに再構成した試験管内実験系が確立された⁽⁶⁾6) H. I. Zgurskaya & H. Nikaido: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7190 (1999).．しかし実際の生細胞内ではAcrAB-TolCは細胞質膜と外膜をまたぐ複合体ポンプとして機能する性質上，排出速度の厳密な定量的測定は再構成系では難しく，排出キネティクスの諸定数の決定は2009年に生細胞を用いたβ-Lactams排出速度測定法が確立されるまで待たれることとなった．排出活性を数値化するためには，1）外膜透過・排出速度が定量的に測定できること，2）ペリプラズムのβ-Lactams濃度（C_p）を測定できること，の2点が肝となる．これらの点は，ペリプラズムに局在するβ-Lactams分解酵素（β-Lactamase）による加水分解反応を検出する方策を取ることで解決された．すなわち，β-Lactamsを外的投与したときの外膜透過速度をV_in，排出速度をV_e，加水分解速度をV_hとすると，これらは定常状態でV_in＝V_e＋V_hの関係を取る（図1B図1■グラム陰性細菌に対する薬剤の挙動）（少なくとも15分程度の実験条件下では定常状態を保つことが確認されている）．β-Lactamsの加水分解反応は比色分析により検出できるためV_hが実測値として得られ，さらにC_pがミカエリス–メンテン式C_p＝V_h･K_m/（V_max−V_h）（V_maxとK_mは細胞破砕液中のβ-lactamase活性から求められる）から算出される．ポンプ機能を脱共役剤の投与もしくはacrB遺伝子の破壊により欠失させると，V_in＝V_hとなり，V_inが得られる．外膜透過は非特異的な受動拡散であるため，フィックの拡散方程式V_in＝P･A･（C_o−C_p）（C_oは細胞外濃度，Pは透過係数，Aは細胞表面積で大腸菌の場合132 cm²/mg [cell dry weight]）に従い，V_inとC_pの算出値からPが求められる．最終段階として同様の実験をacrB^＋株で行うと，V_in＝V_e＋V_hとなるため，V_inの理論値[＝P･A･（C_o−C_p）]とV_hの実測値との差がV_eとして求められる．測定結果を例示すると，penicillin Gの外膜透過係数はP＝0.07×10⁻⁵ cm/s，排出キネティクスの定数（下記を参照）はV_max＝0.085 nmol/s/mg [cell dry weight]，K_0.5＝0.3 μM，ヒル定数h＝4.0である⁽³⁾3) S. Kojima & H. Nikaido: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, E2629 (2013)..

測定結果から見えてくること

現在までに13種のβ-Lactamsの排出キネティクスが測定されている．Nitrocefinを除くすべてのβ-Lactamsにおいて，V_e値をC_pに対してプロットするとヒル方程式V_e＝V_max･C_p^h/（K_0.5^h＋C_p^h）（hはヒル定数）に従うS字型飽和曲線が得られる．このタイプの曲線はAcrBの排出動作に正の協同作用（positive cooperativity）があることを示している．2006年にAcrBと基質の共結晶構造が解かれた際にAcrBの動作原理として3量体間の協同作用がすでに推定されていたが^{(7, 8)}7) S. Murakami, R. Nakashima, E. Yamashita, T. Matsumoto & A. Yamaguchi: Nature, 443, 173 (2006).8) M. A. Seeger, A. Schiefner, T. Eicher, F. Verrey, K. Diederichs & K. M. Pos: Science, 313, 1295 (2006).，これを実験事実として裏づけている．基質の親和性を示すK_0.5（K_mに相当）は親水的なセフェム系β-Lactamsで5～300 μM，より疎水的なペニシリン系β-Lactamsで1 μM前後である．また，外膜透過・排出の両方が数値化されたことにより，β-Lactams耐性を定量的な視点で理解することが可能になった．β-Lactamsの標的はペリプラズムに局在するペニシリン結合タンパク質なので，耐性は投与濃度（C_o）に対してC_pをどのくらい低く抑えられるかで決まる．C_oとC_pの対応関係はV_in＝V_e＋V_hに実験で得られた諸定数を代入すると理論値として算出でき（理論値は実測したC_o vs. C_pプロットとよく一致する），これを利用して透過障壁・排出活性・β-Lactamase活性の耐性への寄与が概観できる．図1C図1■グラム陰性細菌に対する薬剤の挙動は例としてpenicillin GのC_oとC_pの対応関係を，透過障壁性，排出活性およびβ-Lactamase活性がそれぞれ1/5倍および5倍になった場合を仮定し算出したものである．C_pの値は透過障壁性と排出活性に著しく依存しており，両者の寄与の大きさが図から明らかである．したがって細菌にとっては透過障壁性と排出活性を上げることが耐性獲得に最も有効な手段となっていることがわかる．これは現実の多剤耐性菌の多くで外膜チャネルの欠失（これにより透過障壁性が上がる）と多剤排出ポンプの発現増加が同時に起こっていることからも確認できる⁽⁴⁾4) X. Z. Li, P. Plésiat & H. Nikaido: Clin. Microbiol. Rev., 28, 337 (2015).．

以上がβ-Lactamsの外膜透過・排出測定結果から得られる示唆である．細胞質内の因子を標的とするほかの薬剤の排出キネティクスは測定されていないが，いずれの薬剤もペリプラズムを通過する以上, β-Lactamsと同様に透過障壁性と排出活性が多剤耐性の主因となることは疑いようがない．多剤耐性問題の解決には透過障壁性の克服と排出活性の阻害が鍵となる．排出ポンプ阻害剤は研究・開発が進んでおり，排出活性を効果的に阻害できる数種の化合物が既に報告されている^{(9, 10)}9) T. J. Opperman, S. M. Kwasny, H. S. Kim, S. T. Nguyen, C. Houseweart, S. D'Souza, G. C. Walker, N. P. Peet, H. Nikaido & T. L. Bowlin: Antimicrob. Agents Chemother., 58, 722 (2014).10) R. Nakashima, K. Sakurai, S. Yamasaki, K. Hayashi, C. Nagata, K. Hoshino, Y. Onodera, K. Nishino & A. Yamaguchi: Nature, 500, 102 (2013).．現時点で実用化されたものはないが今後の進展が待たれる．一方，ポリミキシン系抗生物質は外膜透過障壁性を破壊することが知られているが腎毒性が強く有効な薬剤となり得ていない．透過障壁性の克服には新たな研究展開が望まれる．