はじめに

近年，多くの食品由来成分の代謝改善作用が明らかになり，その作用機構が精力的に解析されている．食品成分のもつ抗酸化能がその代謝改善作用に寄与することは広く知られているが，それ以外の作用機構も明らかになりつつある．本稿ではフラボノイドに分類されるルテオリンを取り上げ，これまでに知られている代謝改善作用に加えて，その分子レベルでの作用機構について概説する．また，われわれが最近報告した，ルテオリンによる核内受容体HNF4α （hepatocyte nuclear factor 4α）の活性抑制作用についても紹介する．

フラボノイド

疫学的な調査では，植物由来食品の摂取は，動脈硬化などの慢性疾患発症リスクを低下させることが示されている⁽¹⁾1) M. Lopez-Lazaro: Mini Rev. Med. Chem., 9, 31 (2009).．この予防作用に，植物に含まれるどの成分が寄与するかは厳密には不明であるが，その有力な候補としてフラボノイドを挙げることができる．フラボノイドはジフェニルプロパン構造（C6–C3–C6）を特徴とする化合物群の総称であり（図1図1■代表的なフラボノイドの基本骨格），野菜や果物に広く含まれている．フラボノイドは植物の二次代謝産物であり，植物においては紫外線から身を守るために産生されると考えられているが，ヒトが摂取することによりさまざまな抗生活習慣病作用を発揮する．別の疫学的な調査では，フラボノイドを多く含む食事は心血管疾患のみならず，がん発症のリスクを低減させることも示されている．また，伝統薬として広範な病気の治療に使用されてきた植物の研究からも，フラボノイドがこれらの植物に含まれる生理活性物質であることが示されている⁽¹⁾1) M. Lopez-Lazaro: Mini Rev. Med. Chem., 9, 31 (2009).．

図1■代表的なフラボノイドの基本骨格

ルテオリン

ルテオリンは，多くの植物性食品や伝統薬として使用される植物に含まれる代表的なフラボノイドの一つである．ルテオリンはフラボンに分類され，これまでにおよそ300種類の植物に，アグリコンや配糖体として含まれていることが報告されている．多くの配糖体はO-グリコシドであり，5,7,3′,4′の水酸基に配位し，Cynaroside （luteolin 7-O-glucoside）やScolymoside （luteolin 7-O-rutinoside）が代表例である．また，6位や8位のCに配位するC-グリコシドの代表例としては，Orientin （luteolin 8-C-glucoside）やIsoorientin （luteolin 6-C-glucoside）がある．それぞれの構造を図2図2■ルテオリンと代表的なルテオリン配糖体に示す．

図2■ルテオリンと代表的なルテオリン配糖体

核内受容体とフラボノイド

核内受容体は脂溶性のリガンドが結合することでその活性が制御される転写因子であり，ヒトでは48種類が報告されている⁽²⁾2) Z. Zhang, P. E. Burch, A. J. Cooney, R. B. Lanz, F. A. Pereira, J. Wu, R. A. Gibbs, G. Weinstock & D. A. Wheeler: Genome Res., 14, 580 (2004).．脂肪酸をリガンドとするPPARα （peroxisome proliferator-activated receptor α）や胆汁酸をリガンドとするFXR （farnesoid X receptor），さらにはビタミンDや酸化コレステロールをそれぞれリガンドとするVDR （vitamin D receptor）やLXR （liver X receptor）などがある．しかしながら約半数の核内受容体はリガンドが未知であり，オーファン受容体と呼ばれている⁽³⁾3) Y. Shi: Drug Discov. Today, 12, 440 (2007).．

フラボノイドによる転写制御を考えた場合，その標的として核内受容体は想定しやすい．すなわち脂溶性の食品成分が生体に取り込まれ，それが核内受容体のリガンドとして作用することで種々の効果を発揮する可能性が考えられる．実際に，フラボノイドによる核内受容体の活性制御に関する研究は広く行われている．イソフラボンに分類されるダイゼインやゲニステインおよびフラバノンに分類されるナリンゲニンはER （estrogen receptor）に結合し活性化する⁽^{4, 5)}4) Z. Dang & C. W. Lowik: J. Bone Miner. Res., 19, 853 (2004).5) Z. C. Dang, V. Audinot, S. E. Papapoulos, J. A. Boutin & C. W. Lowik: J. Biol. Chem., 278, 962 (2003).．一方で，フラボンであるアピゲニンやクリシンおよびフラボノールであるケンフェロールはPPARγを活性化する⁽^{6, 7)}6) Y. C. Liang, S. H. Tsai, D. C. Tsai, S. Y. Lin-Shiau & J. K. Lin: FEBS Lett., 496, 12 (2001).7) L. Ding, D. Jin & X. Chen: J. Nutr. Biochem., 21, 941 (2010).．

核内受容体HNF4α

HNF4αは核内受容体型の転写因子であり，ホモダイマーとして機能する．その標的遺伝子にはMTP （microsomal triglyceride transfer protein）, ApoB （apolipoprotein B）などのリポプロテイン分泌に関与する遺伝子や，PEPCK （phosphoenolpyruvate carboxykinase），G6Pase （glucose-6-phosphatase）などの糖新生に関与する遺伝子がある．一般的な核内受容体はDNA結合領域とリガンド結合領域をもち，リガンドが結合することでその活性が制御される．HNF4αもDNA結合領域とリガンド結合領域をもつが，内因性のリガンドの有無については明らかになっていない．脂肪酸CoAがリガンドして機能するとの報告もあったが⁽⁸⁾8) R. Hertz, J. Magenheim, I. Berman & J. Bar-Tana: Nature, 392, 512 (1998).，その真偽については議論が残るところである．近年，大腸菌を用いて発現・精製したHNF4αの結晶構造解析により，リガンド結合領域に脂肪酸（ミリスチン酸やパルミチン酸）が配位することが示された⁽⁹⁾9) S. Dhe-Paganon, K. Duda, M. Iwamoto, Y. I. Chi & S. E. Shoelson: J. Biol. Chem., 277, 37973 (2002).．さらに動物細胞に発現させたHNF4αにはリノレン酸が結合していることや，マウス肝臓から精製したHNF4αにはリノレン酸が結合していること，さらにその結合はマウスの摂食状態による影響を受け，絶食により結合が抑制されることが示されている⁽¹⁰⁾10) X. Yuan, T. C. Ta, M. Lin, J. R. Evans, Y. Dong, E. Bolotin, M. A. Sherman, B. M. Forman & F. M. Sladek: PLoS ONE, 4, e5609 (2009).．しかしながら，その結合はHNF4αの活性には影響を与えないことから⁽¹⁰⁾10) X. Yuan, T. C. Ta, M. Lin, J. R. Evans, Y. Dong, E. Bolotin, M. A. Sherman, B. M. Forman & F. M. Sladek: PLoS ONE, 4, e5609 (2009).，脂肪酸はHNF4αの内因性リガンドとして機能しているとは言い難い．HNF4αの内因性リガンドが存在するのか，またリガンドによる活性調節を受けるのかなど，今後のさらなる解析が待たれる．

ルテオリンは食事誘導性の肥満やインスリン抵抗性を改善する

ルテオリンを実験動物に摂取させ，その効果を検証する研究は多く行われている．最近報告された代表的な論文について紹介する．

1. ルテオリンはマスト細胞への作用を介して，食事誘導性の肥満やインスリン抵抗性を改善する

Xuらのグループはマウスへのルテオリン混合食（0.01％（w/w）, 12週間処理）が高脂肪食負荷によるさまざまな影響を改善することを示した⁽¹¹⁾11) N. Xu, L. Zhang, J. Dong, X. Zhang, Y. G. Chen, B. Bao & J. Liu: Mol. Nutr. Food Res., 58, 1258 (2014).．ルテオリンはマスト細胞やマクロファージの脂肪組織への浸潤を抑制し，脂肪組織における炎症性サイトカインレベルを低下させること，さらにマスト細胞由来のIL-6発現を抑制することを示した．IL-6はマスト細胞に起因する代謝変動を担う主要なサイトカインであると考えられており，ルテオリンはマスト細胞スタビライザーとして機能することにより，種々の代謝改善作用を発揮している可能性が示されている．

2. ルテオリンは肝臓と脂肪組織の臓器間相互作用を介して，食事誘導性の脂肪肝やインスリン抵抗性を改善する

Kwonらのグループはマウスへのルテオリン混合食（0.005％（w/w）, 16週間処理）が高脂肪食負荷によるさまざまな影響を改善することを示した⁽¹²⁾12) E. Y. Kwon, U. J. Jung, T. Park, J. W. Yun & M. S. Choi: Diabetes, 64, 1658 (2015).．その効果は抗肥満・抗脂肪肝・抗インスリン抵抗性など，多岐にわたる．さまざまな因子について，mRNA・タンパク質レベルでの発現を検討し，肝臓では脂肪酸合成系の遺伝子発現が低下していること，脂肪組織ではPPARγ発現が上昇しており，脂肪酸取り込みに関与する遺伝子発現を亢進させることで，血中の遊離脂肪酸量を低下させている可能性を示した．さらに脂肪組織では，脂肪酸合成系の遺伝子発現が上昇していたが，脂肪分解やTCA回路に関与する遺伝子発現も上昇していた．これらの遺伝子発現の変動により，脂肪組織ではルテオリン添加食によって脂肪酸合成は上昇するが，一方で脂肪分解やTCA回路も促進される結果として，脂肪滴の形成は抑制され，脂肪量の低下（抗肥満）へとつながる可能性が示されている．以上の結果から，ルテオリンは肝臓と脂肪組織の臓器間相互作用により食事誘導性の影響を改善すると報告した．

ルテオリンによるHNF4α活性抑制を介した抗動脈硬化・抗肥満作用

1. HNF4α活性を抑制する食品成分の探索

われわれは，HNF4α活性を抑制する食品由来成分について，レポーターアッセイを用いた評価系を用いて探索し，フラボンやフラボノール全般にHNF4α活性を抑制する効果を見いだした（抑制活性はフラボン＞フラボノール）⁽¹³⁾13) J. Li, J. Inoue, J. M. Choi, S. Nakamura, Z. Yan, S. Fushinobu, H. Kamada, H. Kato, T. Hashidume, M. Shimizu et al.: J. Biol. Chem., 290, 24021 (2015).．フラボノールに存在するC環3位の水酸基（図1図1■代表的なフラボノイドの基本骨格）がHNF4α活性抑制効果を阻害していると考えられる．一方でイソフラボンであるダイゼインやゲニステインには抑制活性が観察されなかった．イソフラボンはC環3位にB環が配位する形をとっている（図1図1■代表的なフラボノイドの基本骨格）．したがって，C環3位に水酸基が配位するとフラボンに比べ抑制活性が低下し，C環3位にB環が配位すると抑制活性そのものが消失する．これらの結果より，フラボン骨格のC環3位への官能基の配位がHNF4α活性抑制能に影響を及ぼすと考えられる．

2. HNF4α活性に対するルテオリンの効果

フラボンの中でも最も抑制作用の強かったルテオリンに着目し検討を進めた．われわれの検討によって明らかになったルテオリンの作用機序の概要を図3図3■ルテオリンによる生活習慣病予防・改善作用の分子機構に示す．ヒト肝がん由来細胞であるHepG2細胞への10 μMルテオリンの12時間処理はHNF4α標的遺伝子であるMTPおよびApoB遺伝子をはじめPEPCKやG6Paseの遺伝子発現も同様に低下させた．また，ルテオリン処理は，培地中へのApoBタンパク質の分泌についても大きく減少させた．同様の作用は小腸上皮様細胞へと分化させたCaco-2細胞でも観察された．これらの結果から，ルテオリン処理はVLDLおよびキロミクロンの分泌を抑制すると考えられる．一方で，ルテオリン配糖体（図2図2■ルテオリンと代表的なルテオリン配糖体）には上記のような作用は観察されなかった．ルテオリン配糖体は細胞内に取り込まれにくいことが知られていることから⁽¹⁴⁾14) K. Shimoi, H. Okada, M. Furugori, T. Goda, S. Takase, M. Suzuki, Y. Hara, H. Yamamoto & N. Kinae: FEBS Lett., 438, 220 (1998).，ルテオリンは細胞内に取り込まれた後にHNF4α活性を抑制している可能性が考えられる．

図3■ルテオリンによる生活習慣病予防・改善作用の分子機構

3. ルテオリンとHNF4αの結合

ルテオリンとHNF4αの結合の可能性を検証するため，ルテオリンビーズを理化学研究所・ケミカルバイオロジー研究基盤施設の協力により作製した．検証の結果，ルテオリンはHNF4αと結合していることが明らかになった．また，リガンドドッキングツールGOLDを用いてその結合様式をシミュレーションしたところ，H1, H3, H5で形成されるポケットに結合する可能性が示され，これは脂肪酸が結合するポケットとは異なっていた．HNF4αのDNA結合に及ぼすルテオリンの効果をChIPアッセイによって検討したが，ルテオリン処理による変化は観察されなかった．一般的に転写因子の活性はDNA結合能の変化に加え，コファクターとの結合の変化により制御されることから，ルテオリン結合によって，HNF4αへのコアクチベーターの結合が抑制されることが推測される．ルテオリンによるHNF4α活性抑制の詳細な分子機構については，さらなる解析が必要である．

4. 実験動物でのルテオリンの効果

次にマウスを用いたルテオリンの効果の検証を行った．5週齢のC57BL/6マウスに高脂肪食（60％脂肪，HFD）および0.6％ルテオリン添加食を3日間摂食させ，肝臓におけるHNF4α標的遺伝子の発現量を測定した．その結果，MTP, ApoB, PEPCK, G6Pase遺伝子発現はルテオリン食群で有意に低下していた．次に，肥満モデルマウスでのルテオリンの効果を検証した．5週齢のC57BL/6マウスをHFDで11週間飼育し食事誘導性の肥満モデルマウスを作製した．マウスを3群に分け（各群n＝8, HFD群，HFD＋0.6％ルテオリン（HFD＋0.6％Lut）群，HFD＋1.5％ルテオリン（HFD＋1.5％Lut）群），実験食を8週間与えた．群間で摂食量に違いは見られなかった．1日おきに体重を測定したところ，ルテオリン食摂取16日目から，HFD＋1.5％Lut群において有意な体重増加の抑制が観察された．

ルテオリン添加食を給餌後6週間目に血糖値を測定したところ，HFD＋0.6％Lut群では低下傾向が，HFD＋1.5％Lut群では有意な低下が観察された．経口グルコース負荷試験を行ったところ，HFD＋1.5％Lut群において有意な血糖値の低下が観察されたことから，ルテオリン添加食によって肥満モデルマウスの耐糖能が改善されることが明らかになった．

HFD＋1.5％Lut群でキロミクロン-コレステロールは低下傾向で，VLDL, LDL, HDL-コレステロールはいずれも有意な低下が観察された．遊離脂肪酸および総胆汁酸は，HFD＋1.5％Lut群で低下傾向が観察された．興味深いことに，HFD＋1.5％Lut群において肝臓中のトリグリセリドおよびコレステロール量の低下が観察された．血中のApoBタンパク質量はルテオリン添加食で有意に低下していたことから，in vitroで観察されたルテオリンのApoB分泌抑制作用はin vivoでも作用すると考えられる．

以上，ルテオリンがHNF4αに結合しその活性を抑制すること，さらには実験動物でのルテオリンの摂取が抗肥満作用を発揮するとともに血中脂質プロファイルを改善させ，抗動脈硬化作用へとつながる可能性を示した．

おわりに

食品の摂取は栄養素補給に必須であり，これにより生命を維持することができる．食品由来成分に代謝改善作用をもつ化合物を見いだし，利用することができれば，日々摂取する食品を選択することによりさまざまな疾患の予防につながることが期待される．

ルテオリンは植物性食品に広く分布しており，抗肥満・抗糖尿病・抗炎症作用のみならず，抗がん作用をもつことが示されている．また，それらの作用機構も明らかにされつつあり，科学的に根拠のある高機能性食品の開発が可能になってきたといえるだろう．しかし，その有効摂取量を考えると食品素材からではなく，サプリメントとしての摂取が現段階では現実的である．また，長い食経験のある食品に含まれる成分であっても，多量・長期間摂取が生体へ及ぼす影響について，慎重に観察する必要がある．解決すべき問題は山積しているが，食品由来成分のもつ機能性とその作用機構を分子レベルで明らかにすることで，食品による疾患発症の予防・遅延の実現に貢献できればと考えている．