1. 酵素の高活性化・発現増強

最も注目されているバイオエネルギー物質の一つに，石油に含まれる脂肪族化合物であるアルカンがある．新井はシアノバクテリアによるアルカン合成を実用化するため，その過程を触媒する2つの酵素のアミノ酸置換による高活性化を試みた．シアノバクテリア細胞内では，アシルACP還元酵素（AAR）が脂肪酸アシルACPをアルデヒドに還元後，アルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ（ADO）がアルデヒドをアルカンに変換する2段階反応でアルカンが合成されるが（図3B図3■代謝改変により燃料高生産を目指す），これらの酵素活性はとても低い．そこでまず，さまざまなシアノバクテリアに由来するAARとADOの活性を，大腸菌を用いた活性評価法⁽⁴⁾4) Y. Hayashi, F. Yasugi & M. Arai: PLoS ONE, 10, e0122217 (2015).によって比較したところ，S. 7942由来のAARとNostoc punctiforme PCC 73102由来のADOが最も高活性であった．そこで，これらの高活性型AARとADOを構成するアミノ酸一つひとつをアラニンに置き換える網羅的アラニンスキャン変異解析により，高活性化しうる変異部位を探しだし，さらにそれらの部位を野生型以外の19種類のアミノ酸に置換する飽和変異解析によって，高活性化に有効なアミノ酸置換を絞り込んだ．さらに，それらの変異を組み合わせた多重変異体を構築した結果，ついに野生型よりも活性が約3倍にも向上したADO変異体を得ることに成功した．現在，高活性化したAARとADOをS. 6803に導入し，アルカン高生産株の作出をねらっている．

他生物種の遺伝子を導入すれば，アルカンのほかにもシアノバクテリアにさまざまな燃料物質を作らせることができる^{(5, 6)}5) 蘆田弘樹：“藻類オイル開発研究の最前線”，エヌ・ティー・エス，2013, p. 149.6) 蘆田弘樹：生物工学会誌，91, 352 (2013).．蘆田はS. 7942にアルコール発酵菌由来のエタノール合成系遺伝子を導入し，合成されたエタノールが培地中に放出されるエタノール産生株を作出した．そしてエタノール生産性を上げるためにさらに一工夫，光合成炭素固定酵素リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（RuBisCO）の発現量を最適化することによって，光合成能の向上を試みた．シアノバクテリアは，二酸化炭素のみならず酸素をも固定してしまうというRuBisCOの酵素学的欠点を補うため，カルボキシソームと呼ばれる構造体の中に，高い二酸化炭素濃度環境を作り出し，この中でRuBisCOを機能させている．蘆田はS. 7942において，RuBisCOの発現量を人為的に制御すると，カルボキシソームの量と形態が変化し，光合成速度のコントロールが可能であることを見いだした．この知見を活かし，エタノール産生株においてRuBisCOの量を最適化すると（図3C図3■代謝改変により燃料高生産を目指す），ねらいどおり，光合成活性の増加に伴って，エタノール生産量を増加させることができた．この成果により，RuBisCO増強による光合成能の向上が，シアノバクテリアにおいて燃料生産量を増加させる一つの方向性であることが示された．

2. 調節因子の改変

シアノバクテリアが細胞内に貯える多糖グリコーゲンは，重要なエネルギー源物質である．日原はS. 6803において，cyAbrB2という転写因子を欠損すると，細胞体積が野生株の5倍，細胞当たりのグリコーゲン蓄積量が野生株の10倍にも達することを見いだし（図3D図3■代謝改変により燃料高生産を目指す），「器が大きく原料に富む」この株をプラットフォームとした代謝改変により，高蓄積しているグリコーゲンを脂肪酸・油脂に変換できないかと考えた．cyAbrB2欠損株の代謝解析から，cyAbrB2は変動する栄養条件や光条件下で，細胞内の炭素・窒素代謝を円滑に進行させるために必須な転写因子であることが明らかになった⁽⁷⁾7) Y. Kaniya, A. Kizawa, A. Miyagi, M. Kawai-Yamada, H. Uchimiya, Y. Kaneko, Y. Nishiyama & Y. Hihara: Plant Physiol., 162, 1153 (2013).．遊離脂肪酸を培地中に放出する代謝改変を施した株においてcyabrB2遺伝子を破壊したところ，細胞濁度当たりの脂肪酸放出量は対照株の2倍となった⁽⁸⁾8) A. Kawahara, Y. Sato, Y. Saito, Y. Kaneko, Y. Takimura, H. Hagihara & Y. Hihara: J. Biotechnol., 220, 1 (2016).．しかしこの株のグリコーゲン蓄積レベルは依然として高く，今後この余剰炭素を脂肪酸生合成に回す代謝改変に成功すれば，さらなる生産性の向上が期待される．

ポリヒドロキシ酪酸（PHB）は環境中の多様な細菌が生産する生分解性のポリエステルである．S. 6803は窒素やリン欠乏条件下において，ほかのバクテリアと同様にアセチルCoAからの3段階の反応でPHBを合成して細胞内に蓄積する．小山内はこれまでにRNAポリメラーゼシグマ因子SigEが，グリコーゲン分解，解糖系，酸化的ペントースリン酸経路など，糖の分解反応である「糖異化」にかかわる遺伝子群の発現を正に制御すると同時に，PHB合成酵素遺伝子の発現制御にも関与する可能性を示唆する結果を得ていた⁽⁹⁾9) T. Osanai, A. Oikawa, M. Azuma, K. Tanaka, K. Saito, M. Y. Hirai & M. Ikeuchi: J. Biol. Chem., 286, 30962 (2011).．そこでS. 6803においてSigEを過剰発現させたところ，糖異化が促進し，PHB合成酵素の発現量も増加して，窒素欠乏下でのPHB蓄積量は実に野生株の約2.5倍に達した⁽¹⁰⁾10) T. Osanai, K. Numata, A. Oikawa, A. Kuwahara, H. Iijima, Y. Doi, K. Tanaka, K. Saito & M. Y. Hirai: DNA Res., 20, 525 (2013).（図3E図3■代謝改変により燃料高生産を目指す）.

SigEやcyAbrB2のようなグローバル転写因子の改変は，さまざまな細胞機能にかかわる遺伝子の発現を統合的に制御する可能性を秘めており，今後の代謝工学の分野において重要なストラテジーの一つとなると考えられる．成川はこれに加えて，特定の波長の光の照射によっても統合的な遺伝子発現制御が可能であることを示した．シアノバクテリアにおいて，シアノバクテリオクロムと呼ばれる光センサー群が，多様な光質を感知し，走光性や細胞凝集などの光応答現象を制御していることが解明されつつある．シアノバクテリアは光合成はもちろん細胞内情報伝達にも，さまざまな波長の光を有効利用しているのである．成川はこれらのセンサーの光感知機構の解析，その知見に基づいた受容光質の改変，光センサーと制御系の新たな組み合わせによって，細胞外多糖であるセルロース生産の光制御を目指した．このような用途には，光合成活性への影響が小さい遠赤色光や緑色光を用いることが望ましいが，遠赤色と緑色で変換する光センサーは天然には存在しない．そこで，まず赤と緑色光で変換する既存のシアノバクテリオクロムの色素結合領域の結晶構造を決定し⁽¹¹⁾11) R. Narikawa, T. Ishizuka, N. Muraki, T. Shiba, G. Kurisu & M. Ikeuchi: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 918 (2013).，その知見を基に結合色素を改変することで，遠赤色光と橙色光で変換するシアノバクテリオクロムの創出に成功した⁽¹²⁾12) R. Narikawa, T. Nakajima, Y. Aono, K. Fushimi, G. Enomoto, Ni-Ni-Win, S. Itoh, M. Sato & M. Ikeuchi: Sci. Rep., 5, 7950 (2015).．現在，橙色光吸収型を緑色光吸収型に短波長シフトさせる変異導入に取り組んでいる．光スイッチでセルロース合成酵素遺伝子をオンオフすることにより，細胞内のセルロース生産を光で制御する系の構築が期待される（図3F図3■代謝改変により燃料高生産を目指す）．

1. 窒素固定を行うシアノバクテリア

ある種のシアノバクテリアは，環境中のアンモニアや硝酸などの窒素化合物が不足すると，大気中の窒素ガスを固定して窒素源として利用する．しかし，窒素固定反応を触媒するニトロゲナーゼは酸素に非常に弱い酵素であるため，活発に光合成を行い，酸素濃度が上昇した細胞の中では窒素固定を行うことができない．そこで昼は光合成，夜は窒素固定と代謝をスイッチングする種や，光合成を行う栄養細胞からヘテロシストと呼ばれる窒素固定に特化した細胞を分化させる種が出現した．これから紹介する3つの研究は，遺伝子操作技術が確立したモデル生物である，糸状性シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120（以後A. 7120と略す）において，ヘテロシストの特性を活かして高効率な燃料物質生産を目指したものである（図4図4■ヘテロシスト形成する窒素固定シアノバクテリアの代謝改変）．

図4■ヘテロシスト形成する窒素固定シアノバクテリアの代謝改変

ヘテロシストは窒素固定に特化した細胞で，その特性を活かすことで各種の燃料生産が可能である．エタノール生産：エタノール合成経路をヘテロシスト特異的に発現させることで実現した．また，ヘテロシストでの糖代謝を活性化して生産性を向上させることにも成功した．脂肪アルコール生産：ヘテロシスト外から流入する酸素を防ぐバリアを形成する糖脂質の前駆体である脂肪アルコールの蓄積株を作出した．水素生産：ニトロゲナーゼ反応における窒素固定を抑えることで，水素生産の効率と持続性を向上させた．ヘテロシスト形成頻度を増加させることでも，水素生産効率が向上した．OPP…酸化的ペントースリン酸経路．

A. 7120において，十数個の細胞おきに1個の割合で形成されるヘテロシストは細胞分裂せず，細胞内の酸素濃度を低く保つため酸素発生を伴う光合成も行わない．隣接した栄養細胞が光合成により作り出したスクロースを代謝してエネルギーを得て，窒素を固定して栄養細胞に供給し続ける窒素化合物生産細胞としての役割に徹している．得平はこの特性を活かし，ヘテロシストを利用したエタノール生産を試みた．まずヘテロシスト特異的に発現する遺伝子のプロモーターを利用して，エタノール合成系酵素をヘテロシスト内でのみ発現する株を作製した⁽¹³⁾13) S. Ehira: Russ. J. Plant Physiol., 60, 443 (2013).．さらにエタノール生産性を向上させるため，スクロース分解酵素をヘテロシストにおいて過剰発現させ，糖代謝を活性化させた．この代謝改変により，エタノール生産性は2倍に増加した．つづいて培養条件の検討を行い，生産性をさらに10倍に増加させることに成功した．本研究におけるヘテロシストでのエタノール生産量は，単細胞性シアノバクテリアでの生産量と同程度に達している．ヘテロシストの割合は全細胞の10％程度であり，1細胞での生産性を考えると，ヘテロシストは栄養細胞の数倍のエタノールを生産できることが示された．

ヘテロシストは外膜の外側に糖脂質の膜（バリア）を形成し，外からの酸素流入を防いでいる．この糖脂質は脂肪アルコールにグルコースが1分子付加した構造をもち，A. 7120では炭素数26の3価脂肪アルコールが用いられている．粟井はこの糖脂質合成の最後の反応を担う糖転移酵素をコードする遺伝子hglTを同定し，その遺伝子破壊株のヘテロシストでは，糖脂質の膜が形成されず，かわりに前駆体である脂肪アルコールが蓄積することを見いだした．バリアをもたないヘテロシスト内ではニトロゲナーゼは機能しないと予想されたが，実際にはhglT破壊株は，野生株よりは低いものの窒素固定活性をもっており，窒素欠乏条件で生育できることがわかった．このようにして，窒素固定能を維持しつつ，エネルギー物質である脂肪アルコールを蓄積する株を得ることができた⁽¹⁴⁾14) H. S. M. Halimatul, S. Ehira & K. Awai: Biochem. Biophys. Res. Commun., 450, 178 (2014).．現在は，ヘテロシスト分化の制御因子を改変することにより，ヘテロシストの出現頻度を調整し，より多くの脂肪アルコールを生産する株の開発を進めている．

水素は，将来のクリーンな再生可能エネルギーとして注目されている．現在，その大半は化石燃料から製造されているが，将来的には太陽光などの再生可能エネルギーを用いて二酸化炭素排出を伴わない水素生産システムが期待される．ヘテロシスト中のニトロゲナーゼは，空気中の窒素ガスをアンモニアへと固定する際に必然的な副産物として水素を発生する．増川はこの水素生産活性に着目し，A. 7120に遺伝子改変を施して，太陽光をエネルギー源，水を電子供与体とした光合成的水素生産の実現を目指した．まず，ヘテロシスト形成頻度を増加させれば水素生産性も増加すると考え，ヘテロシスト形成の調節遺伝子の変異株を作製した．その結果，ヘテロシスト形成頻度，水素生産活性とも約2倍上昇させることに成功した．次にニトロゲナーゼの活性中心部位近傍アミノ酸残基の改変により，アンモニア合成が抑制され，窒素ガス気相下で高い水素生産活性が保たれる変異株を作製した⁽¹⁵⁾15) H. Masukawa, M. Kitashima, K. Inoue, H. Sakurai & R. P. Hausinge: Ambio, 41(Suppl. 2), 169 (2012).．それまでは，ニトロゲナーゼ反応の産物であるアンモニアがニトロゲナーゼ自身の活性を低下させることが問題であったが，アンモニア合成を抑制することにより，高い水素生産活性が3週間にわたり持続するという，培養の低コスト化につながる成果を得た⁽¹⁶⁾16) H. Masukawa, H. Sakurai, R. Hausinger & K. Inoue: Int. J. Hydrogen Energy, 39, 19444 (2014).．

以上の3つの研究例は，栄養細胞とは独立に，ヘテロシストの代謝のみを改変して物質生産細胞として利用可能であることを示した．今後，栄養細胞とヘテロシストの代謝系をそれぞれ改変することにより，生産性向上の相乗効果も期待できる．糸状性シアノバクテリアの分化細胞ヘテロシストは，バイオ燃料生産の有力なオプションとして，今後精力的に開発が進められていくだろう．

2. 自己溶菌するシアノバクテリア

バイオ燃料生産を実用化するためには，使用する藻種や目的物質を高生産させる技術に加え，回収法についても検討する必要がある．朝山は，細胞増殖が速く，二酸化炭素固定能にも優れており，培養条件に依存して自己溶菌する特徴を有するシアノバクテリアPseudanabaena（Limnothrix） sp. ABRG5-3株に着眼し，有用物質を高生産しそれを簡便に回収する技術の開発を目指した．まずABRG5-3株の最も際立った特徴である自己溶菌についての解析を行い，「振とう→静置の二段階培養」に「暗黒条件」を加えることで，低コストかつ容易に自己溶菌を誘導できることを見いだした．また，ポリリン酸が溶菌直前の細胞内で顕著に蓄積していることを突き止めた⁽¹⁷⁾17) C. Kitazaki, S. Numano, A. Takanezawa, T. Nishizawa, M. Shirai & M. Asayama: Biosci. Biotechnol. Biochem., 77, 2339 (2013).．ポリリン酸の蓄積は一般的には生存戦略であるが，ABRG5-3株の場合は，ポリリン酸蓄積が逆にストレスとなって細胞構造の歪みを誘発し，溶菌を引き起こしている可能性がある．次に，任意のバイオ燃料を効率良く生産させるための藻発現ベクターを構築し，これを用いてアルカンをABRG5-3株細胞内に高生産させ，細胞を自己溶菌させて培地中から目的物質を回収することに成功した⁽¹⁸⁾18) S. Yoshida, M. Takahashi, A. Ikeda, H. Fukuda, C. Kitazaki & M. Asayama: J. Biochem., 157, 519 (2015).（図5A図5■さまざまなシアノバクテリアの特性を活かした燃料生産）．現在，高密度培養のための装置の開発も手掛けており，これらの技術を組み合わせることにより，目的物質生産性向上の相乗効果が期待される．

図5■さまざまなシアノバクテリアの特性を活かした燃料生産

A. 生産した有用物質を回収する際，通常のシアノバクテリアでは細胞を破砕する必要があるが，ABRG5-3株の場合，自己溶菌させた後に培養上澄液より目的物質（バイオ燃料や青色素タンパク質フィコシアニンなど）を簡便に回収できる．B. Chl aおよびChl fの構造および吸収スペクトル．C. スピルリナ（Arthrospira platensis）から得られた光合成膜集積電極を作用極，酵素固定電極を対極とした太陽光駆動型バイオ燃料電池の模式図．光合成膜集積電極：酸化チタンナノ結晶薄膜上に光合成膜を集積．酵素固定電極：電極表面に形成したビオローゲン薄膜上にギ酸脱水素酵素を集積．

3. 長波長光を吸収するクロロフィルをもつシアノバクテリア

希薄な太陽光エネルギーを生命活動に利用するため，光合成生物は集光性色素クロロフィルを用いて光を濃縮している．これまでに同定されたクロロフィルはすべて，太陽光の吸収極大である約400～700 nmの可視領域に吸収帯をもつことから，太陽光エネルギーの4割を占める700 nmより長波長の近赤外光は光合成に用いることができないと従来考えられていた．ところが近年，いくつかのシアノバクテリア種から，700 nmよりも長波長の光を吸収するクロロフィル分子種が単離同定された．鞆はその中で最も長波長側に吸収極大が存在するChl fを含むHalomicronema hongdechlorisの集光装置に着目し，そのエネルギー移動機構の解明を目指した．クロロフィルはクロリン環の側鎖が変化することにより，吸収特性が変化する．もっとも一般的なクロロフィルであるChl aのクロリン環C2位の側鎖がメチル基からホルミル基に変わったものがChl fである（図5B図5■さまざまなシアノバクテリアの特性を活かした燃料生産）．H. hongdechlorisは白色光培養ではChl aのみをクロロフィルとしてもつが，700 nmより長波長側の光で培養すると最大10％のChl fを蓄積する．この条件で培養したシアノバクテリアを用いてエネルギー移動の測定を行った．その結果，低温においてフェムト秒レーザーで励起後すぐにChl aからChl fへのエネルギー移動が観測されたこと，室温においてChl f励起後，Chl a帯での吸収変化が観測されたことなどから，Chl fがある特定のChl aの近傍に位置し，互いにエネルギーを共有していることが明らかになった．この結果は，室温で起きうる低エネルギー側から高エネルギー側へのアップヒルなエネルギー移動が，700 nmより長波長側の光での光合成を可能にしていることを示している^{(19, 20)}19) T. Tomo, T. Shinoda, M. Chen, S. I. Allakhverdiev & S. Akimoto: Biochim. Biophys. Acta, 1837, 1484 (2014).20) S. Akimoto, T. Shinoda, M. Chen, S. I. Allakhverdie & T. Tomo: Photosynth. Res., 125, 115 (2015).．Chl fを用いた光エネルギー変換の仕組みを解き明かすことができれば，われわれの眼には極めて暗く見える近赤外光のエネルギーを用いることが可能となり，太陽光をあますことなく使用したエネルギー生産が実現すると考えられる．