産業用酵素の歴史は今からおよそ150年前，仔牛の胃から抽出されたプロテアーゼ（キモシン）がチーズ製造用に世界で初めて商業化されたことから始まった．それ以降，さまざまな生物から多種多様な酵素が次々と発見され，商業化されることで酵素産業は大きく拡大してきた．現在では，哺乳動物の組織のみならず，植物，微生物も供給源とするさまざまな酵素が，食品，医薬，診断，化粧品，繊維，製紙，洗剤，環境浄化など，多くの産業分野で利用されている⁽¹⁾1) M. Ghaffari-Moghaddam, H. Eslahi, D. Omay & E. Zakipour-Rahimabadi: Rev. J. Chem., 4, 341 (2014).．

酵素は優れた触媒と言われるが，それは常温常圧で進む高い反応効率，特定の物質だけに作用する基質特異性，一つの反応だけを進める反応選択性といった触媒機能による．これらの機能は無機触媒では達成しがたく，したがって，酵素の産業分野における利用価値を高めてきた．一方，近年の酵素利用分野の拡がりに伴い，用途もより複雑なもの，高度なものへとシフトしてきている．酵素も万能ではないため，用途によっては基質特異性などが不十分で実用化に至らないケースも少なくない．そのため，酵素の触媒機能の改変は産業利用における重要な課題である．

酵素の触媒機能を人工的に改変することを酵素工学という．酵素工学にはいくつかのアプローチが知られているが，そのなかでも理論設計と進化分子工学が広く用いられている^{(2, 3)}2) W. S. Mak & J. B. Siegel: Curr. Opin. Struct. Biol., 27, 87 (2014).3) H. Xiao, Z. Bao & H. Zhao: Ind. Eng. Chem. Res., 54, 4011 (2015).．理論設計は，酵素の立体構造と反応機構の情報をもとに目的とする触媒機能の達成に有効と思われる部位を予想し，その部位に狙ってアミノ酸変異を導入することで改変を行う⁽²⁾2) W. S. Mak & J. B. Siegel: Curr. Opin. Struct. Biol., 27, 87 (2014).．一方，進化分子工学は立体構造情報には依存せず，ランダム（無作為）に変異を導入した数万～数百万の変異体ライブラリーを構築し，その中から目的とする触媒機能をもつ変異体をハイスループットアッセイ法によって選別する⁽³⁾3) H. Xiao, Z. Bao & H. Zhao: Ind. Eng. Chem. Res., 54, 4011 (2015).．いずれも多くの研究者による長年の努力によって技術基盤がよく確立されており，多数の成功例が報告されている．ところが，これらのアプローチはすべての酵素でうまくいくとは限らない．特に産業用酵素においては，理論設計で鍵となる立体構造情報が得られていないものがいまだに多い．また，進化分子工学では膨大な数の変異体を作製・評価するため，異種宿主（特に形質転換能の高い大腸菌）による活性をもつ酵素の発現とハイスループットアッセイ法が鍵となるが，多くの場合，封入体形成や複雑な反応系のためにそれらの確立が難しい．したがって，理論設計や進化分子工学といった従来のアプローチだけでは，産業用酵素の触媒機能の改変は難しいのが現状であった．

われわれは最近，従来とは根本的に異なる新しいアプローチによって酵素触媒機能の改変に成功した⁽⁴⁾4) S.-I. Tanaka, T. Takahashi, A. Koide, S. Ishihara, S. Koikeda & S. Koide: Nat. Chem. Biol., 11, 762 (2015).．具体的には，酵素には手を加えず，人工結合タンパク質の一つであるモノボディを活性中心近傍に結合させることで基質特異性を改変するというものである（図1図1■基質特異性を改変するモノボディ）．モノボディとは，フィブロネクチンIII型ドメイン（FN3）を鋳型とする約90アミノ酸からなる人工結合タンパク質である．FN3ドメインは免疫グロブリンフォールド（抗体様の構造）の極めて安定な構造をもち，構造表面に露出した部位（ループやβ-ストランドの溶媒露出部位）における多数のアミノ酸変異に耐えうる（図1a図1■基質特異性を改変するモノボディ）．その構造表面のアミノ酸配列を多様化したコンビナトリアルライブラリーから，ファージディスプレイ，酵母ディスプレイによる選別を経て，ターゲットに特異的に結合するモノボディを効率的に創り出すことが可能である⁽⁵⁾5) A. Koide, J. Wojcik, R. N. Gilbreth, R. J. Hoey & S. Koide: J. Mol. Biol., 415, 393 (2012).．本アプローチの優れた点として，以下のものを挙げることができるだろう．まず，モノボディは活性中心のような機能性部位に好んで結合するため，酵素の立体構造情報がなくとも活性中心近傍に結合するモノボディを容易に取得できる⁽⁶⁾6) F. Sha, G. Salzman, A. Gupta & S. Koide: Protein Sci., published online, DOI:10.1002/pro.3148 (2017).．そして，“活性中心近傍に結合するが、（適宜な簡易アッセイによって）活性は阻害しない”ことを指標に選別することで，基質特異性を改変するモノボディを選択的に濃縮できる（図1b図1■基質特異性を改変するモノボディ）．つまり，この選別によって評価候補となるモノボディの数を大幅に絞り込むことができるため，ハイスループットアッセイ法が必ずしも必要ではなくなる．さらに，改変対象となる酵素には手を加えないため，異種宿主による遺伝子発現を必要としない．

図1■基質特異性を改変するモノボディ

（a）モノボディの立体構造．アミノ酸配列を多様化した部位を球体で示す．文献5図1図1■基質特異性を改変するモノボディより改変．（b）活性中心近傍に結合するモノボディ．活性中心を塞ぐ位置に結合するモノボディは活性を阻害する（上）．活性中心を塞がないモノボディは活性を阻害せず，基質特異性を改変する（下）．文献4図1図1■基質特異性を改変するモノボディより改変．

実証研究として行ったBacillus circulans由来β-ガラクトシダーゼ（BcBgaD）の基質特異性の改変では，本アプローチの有効性を見事に示すことができた⁽⁴⁾4) S.-I. Tanaka, T. Takahashi, A. Koide, S. Ishihara, S. Koikeda & S. Koide: Nat. Chem. Biol., 11, 762 (2015).．BcBgaDはラクトース分解活性に加え，ガラクトースをほかの糖に転移するガラクトース転移活性（ガラクトオリゴ糖合成活性）をもつ．特にガラクトオリゴ糖の合成活性に優れ，短いもの（2糖）から長いもの（10糖）まで多様なオリゴ糖を生成する酵素である⁽⁷⁾7) D. P. M. Torres, M. P. Gonçalves, J. A. Teixeira & L. R. Rodrigues: Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 9, 438 (2010).（図2図2■モノボディによるBcBgaDの基質特異性の改変，左）．ガラクトオリゴ糖は整腸作用などのプレバイオティクスとしての機能をもつが，特に3糖にその機能の高いことが報告されているため⁽⁸⁾8) F. Depeint, G. Tzortzis, J. Vulevic, K. I’anson & G. R. Gibson: Am. J. Clin. Nutr., 87, 785 (2008).，BcBgaDによる4糖以上のオリゴ糖の生成を抑制し，3糖の生成を高めるような基質特異性の改変が望まれていた．しかしながら，BcBgaDの立体構造情報は長年明らかになっておらず，また，オリゴ糖合成活性を評価するハイスループットアッセイ法はいまだ確立されていないため，その改変は実現していなかった．実証研究の詳細については引用論文を参照されたいが，われわれはまず，BcBgaDの基質結合部位は一般的な糖分解・転移酵素のように複数のサブサイトから構成されていると想定し，特定のサブサイトへのモノボディの結合によって4糖以上のオリゴ糖の生成を抑制するというモデルを考えた（図2図2■モノボディによるBcBgaDの基質特異性の改変，右）．このモデルに従い，BcBgaDの活性中心近傍に結合するが，ラクトース分解活性は阻害しないモノボディを選別した．20個のモノボディについてオリゴ糖合成活性への影響を評価し，その中から，4糖以上のオリゴ糖の生成を抑制し，3糖の生成を高めるモノボディを見いだすことができた．この20個という評価数はほかのアプローチで必要な評価数よりも格段に少なく，そのため，ハイスループットアッセイ法は必要とされなかった．つまり，立体構造情報もハイスループットアッセイ法も使うことなく，目的とする基質特異性の改変を達成することができた．もちろん，BcBgaDには手を加えずに，である．

図2■モノボディによるBcBgaDの基質特異性の改変

想定したサブサイトを−1, ＋1, ＋2, ＋3, 触媒反応の起こる活性中心を赤三角（−1と＋1の間）で示す．（左）BcBgaDは2糖から10糖までのガラクトオリゴ糖を合成する．（右）サブサイトの一つ（＋3）に結合するモノボディが，アクセプターとなる糖を制限し，4糖以上のガラクトオリゴ糖の生成を抑制する．一方，−1と＋1に結合するラクトースの分解活性は阻害しない．文献4 graphical abstractより改変．

先にも述べたが，理論設計と進化分子工学を主なアプローチとしてきた酵素工学はこれまでに多くの成功例を示してきた．一方で，その有用性は限定的なところもあり，従来のアプローチでは難しく，触媒機能の改変が諦められていた酵素は少なくない．今回われわれが示したのは，そのような酵素でも改変を可能にするアプローチである．言い換えれば，酵素工学の有用性を大幅に拡げるアプローチでもある．今後，われわれの示したアプローチが，酵素の触媒機能の改変と産業分野への実用化に貢献できることを期待している．