Kagaku to Seibutsu 55(5): 359-363 (2017)
テクノロジーイノベーション
特定のゲノム領域をDNA脱メチル化する手法の開発CRISPR/Cas9ゲノム編集を応用したエピゲノム操作法
Published: 2017-04-20
© 2017 Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry
© 2017 公益社団法人日本農芸化学会
エピジェネティックスとは，DNAの塩基配列に依存せず，細胞分裂を通じて継承されるシステムである．その実態はDNAのメチル化やヒストン修飾であり，エピゲノムと呼ばれる．DNAメチル化は，DNAのシトシン塩基5位の炭素にメチル基が付与されるもので，一般的にDNAメチル化が起こると遺伝子は転写抑制に働く．またヒストンH3の9番目リジン（H3K9）のメチル化やH3K27のメチル化は転写抑制に働き，H3K4のメチル化やH3K27のアセチル化は転写活性化に働く．
エピジェネティック修飾は，生命の発生や分化における遺伝子発現制御に重要な役割をもち，さらにその異常はがんや生活習慣病といったさまざまな疾患の基盤となることが明らかになってきた．それはエピゲノムの異常を修正することで，疾患が治癒可能になることを意味する．実際，化合物などによる治療やその開発が進められており，たとえばアザシチジンやデシタビンといったDNAメチル基転移酵素阻害剤が骨髄異型性症候群などの治療に，4種類のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が皮膚T細胞リンパ腫や多発性骨髄腫の治療に使用されている．これらは非常に効果のある治療薬であるが，広範囲にDNA脱メチル化やヒストンアセチル化が起こるため副作用のリスクが指摘されている．したがって特定の領域のDNAメチル化，あるいはヒストン修飾を操作する技術の必要性に迫られている．
近年，ゲノム編集法が注目を集めている．ゲノム編集とはゲノムの特定部位の配列を削除したり，あるいは特定部位に任意のゲノム配列を挿入，置換したりする新しい遺伝子改変技術である（図1図1■現在までに開発されたゲノム編集法のモデル図）．1996年にZFN(1)1) M. H. Porteus & D. Carroll: Nat. Biotechnol., 23, 967 (2005).が，2011年にTALEN(2)2) J. C. Miller, S. Tan, G. Qiao, K. A. Barlow, J. Wang, D. F. Xia, X. Meng, D. E. Paschon, E. Leung, S. J. Hinkley et al.: Nat. Biotechnol., 29, 143 (2011).が開発されたが，これらはDNA配列を認識する結合ドメインと制限酵素であるFokIを結合させた人工制限酵素であり，ターゲット配列ごとにこれらを合成する必要があるため，作成に労力と時間がかかった．2012年にCRISPR/Cas9システム(3～5)3) M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna & E. Charpentier: Science, 337, 816 (2012).4) P. Mali, J. Aach, P. B. Stranges, K. M. Esvelt, M. Moosburner, S. Kosuri, L. Yang & G. M. Church: Science, 339, 823 (2013).5) L. Cong, F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P. D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L. A. Marraffini et al.: Science, 339, 819 (2013).が登場すると，簡便性ゆえに急速にその利用が広まった．CRISPR/Cas9システムはターゲット配列を含む短いRNA（sgRNA）とCas9というバクテリア由来のDNA2本鎖切断酵素よりなる．この酵素はsgRNAに含まれるターゲット配列依存的にDNAを切断する．つまり，DNA配列ごとに異なるタンパク質を作製する必要がなく，また標的配列のデザインが簡便であるため，従来のゲノム編集法と比較して迅速にゲノム編集ができるという特徴がある．
図1■現在までに開発されたゲノム編集法のモデル図
（a）ZFN DNA結合部位は3個のジンクフィンガータンパク質からなる．1個のジンクフィンガーはDNA3塩基を認識し，DNA結合部位全体で9塩基を認識する．（b）TALEN DNA結合部位は15個程度のテールリピートよりなる．1個のテールリピートはDNA1塩基を認識する．（c）CRISPR/Cas9 DNA結合部位はRNAであるsgRNAで20塩基を認識する．sgRNAのDNA認識によりCas9がDNAを切断する．
これらのゲノム編集技術を応用すれば，エピジェネティック修飾を改変する「エピゲノム編集」も可能となる(6)6) P. I. Thakore, J. B. Black, I. B. Hilton & C. A. Gersbach: Nat. Methods, 13, 127 (2016).．それはゲノム編集技術で使われる特定のDNA配列に結合できる「特異的DNA配列結合モジュール」を少し改変し，切断活性はないが特定のDNA配列に結合できるものにする．これにエピゲノムを修飾する酵素である「エフェクターモジュール」を連結する（図2図2■エピゲノム編集のストラテジー）．このようなシステムで，エピゲノムを操作することが可能となり，特定遺伝子の発現を活性化したり抑制したりすることができる．
図2■エピゲノム編集のストラテジー
DNA切断活性のない特異的DNA配列結合モジュールとエピゲノム修飾を入れたり消去したりする酵素であるエフェクターモジュールを連結したシステムにより，エピゲノムを操作することが可能となる．
今回，私たちはCRISPR/Cas9の技術を応用し，エピトープタグの一つであるSunTagシステムと組み合わせることで，特定のDNAメチル化領域を効率的に脱メチル化する系を開発した(7)7) S. Morita, H. Noguchi, T. Horii, K. Nakabayashi, M. Kimura, K. Okamura, A. Sakai, H. Nakashima, K. Hata, K. Nakashima et al.: Nat. Biotechnol., 34, 1060 (2016).．
先ほども述べたように，DNAのメチル化は生命の発生や分化における遺伝子発現制御に重要な役割をもち，さらにある特定の遺伝子群が父親由来か母親由来かによって発現パターンに影響を与える現象（ゲノムインプリンティング）や，女性がもっている2つのX染色体のうち一つが不活性化されるという現象（X染色体不活性化）にも深くかかわっている．DNAメチル化はDNAメチル基転移酵素（DNA methyltransferase; DNMT）により確立される．DNAの脱メチル化はTen-eleven translocation 1（TET1）により酸化され5mCが5hmCに変化し，さらには5fC, 5caCに変換されたのちDNAグリコシラーゼのTDGなどにより塩基除去修復されることによって起こる（図3図3■DNAメチル化・脱メチル化）．
図3■DNAメチル化・脱メチル化
DNAのメチル化はDNAメチルトランスフェラーゼ（DNA methyltransferase; DNMT）によりCpGジヌクレオチド内のシトシンの5位の炭素にメチル基を付加することによって起こる．DNAの脱メチル化はTen-eleven translocation 1（TET1）により酸化され5mCが5hmCに変化し，さらには5fC, 5caCに変換されたのちDNAグリコシラーゼのTDGにより塩基除去修復されることによって起こる．
現在までに報告されているエピゲノム編集はほとんどがDNA特異的配列結合タンパク質とエピゲノム修飾するタンパク質の結合によるものであった．そこで私たちはdCas9（標的配列を含むガイドRNAと複合体を形成し，標的配列に結合するが，DNA切断活性はないCas9の変異体である），およびTET1を結合させることで狙った領域のDNA脱メチル化がどの程度可能かを検討した．DNA脱メチル化を試みた領域はGlial Fibrillary Acidic Protein（Gfap）の転写調節領域であり，マウスES細胞においては高度にDNAメチル化されている．このGfapという遺伝子はアストロサイトの分化に重要な遺伝子であり，胎生中期では神経前駆細胞において転写調節領域は高度にDNAメチル化されている．しかし胎生後期ではこの領域のDNA脱メチル化が起こり，神経前駆細胞はアストロサイトに分化できるようになる(8)8) T. Takizawa, K. Nakashima, M. Namihira, W. Ochiai, A. Uemura, M. Yanagisawa, N. Fujita, M. Nakao & T. Taga: Dev. Cell, 1, 749 (2001).．dCas9とDNA脱メチル化酵素TET1の融合タンパク質ではDNA脱メチル化される効率が10％程度にとどまり，さらなる改善の余地があると考えられた．
dCas9とDNA脱メチル化酵素TET1の融合タンパク質では，一つのdCas9に対して一つのTET1しか機能できない（図4a図4■dCas9とSunTag法の組み合わせのモデル図）．そこで，一つのdCas9に対し複数のTET1をリクルートすることができればDNA脱メチル化効率も上昇するのではないかと予想し，SunTagのシステムを取り入れることにした(9)9) M. E. Tanenbaum, L. A. Gilbert, L. S. Qi, J. S. Weissman & R. D. Vale: Cell, 159, 635 (2014).（図4b図4■dCas9とSunTag法の組み合わせのモデル図）．SunTagは5アミノ酸のリンカーで分割された10コピーのGCN4ペプチドから構成されており，GCN4をミニ抗体が認識するシステムである．つまり，（1）dCas9のうしろにGCN4をつなげたものと（2）GCN4を認識して結合するミニ抗体にTET1を融合したものを同時に細胞に導入してDNA脱メチル化の効率を調べた．ところが，予想に反してdCas9とDNA脱メチル化酵素TET1の融合タンパク質と比較してDNA脱メチル化効率はほとんど上がらなかった．複数のTET1がdCas9のDNA結合領域に集まっていてDNA脱メチル化活性は高いはずなのに，なぜ効率が上がらないのか？
図4■dCas9とSunTag法の組み合わせのモデル図
（a） dCas9とDNA脱メチル化酵素TET1の融合タンパク質，（b） dCas9とSunTag法の組み合わせもの，リンカーの長さが5アミノ酸，（c） dCas9とSunTag法の組み合わせもの，リンカーの長さが22アミノ酸．リンカーの長さが短いとおそらく立体障害によりうまくTETが機能しない．リンカーの長さを大きくすることでTETは機能できるようだ．
この原因として，TET1が結合できるGCN4の間（リンカー）が狭すぎるため，互いのTET1が邪魔しあって立体障害を引き起こし，結果としてうまく機能しないのではないかと考えた（図4b, c図4■dCas9とSunTag法の組み合わせのモデル図）．そこで，もともと5アミノ酸であったリンカーの長さを22アミノ酸（図4c図4■dCas9とSunTag法の組み合わせのモデル図），43アミノ酸と広げてみた．すると，今度はマウスES細胞におけるGfap転写調節領域の脱メチル化の割合はそれぞれ40％，30％まで上昇した．
リンカー長が22アミノ酸のものを遺伝子導入した細胞を，ミニ抗体に組み込まれているGFPを指標にしてFACSによりsortingしたところ，脱メチル化効率は90％を超えていた．このシステムによりDNA脱メチル化される領域は，少なくともgRNA target siteを含む約200 bpに及んでいた．また複数のgRNAを導入することでより広い領域においてDNA脱メチル化することが可能であることも明らかとなった．
このようなエピゲノム編集の技術においては，標的配列以外の類似配列に影響を与える場合があり（オフターゲット効果），このような非特異的な反応は安全性の観点からできるだけ低くしておかなければいけない．私たちの開発したシステムにおいて非特異的なDNA脱メチル化が起こっていないか調べるために，whole genome bisulfite sequencingを行った．その結果，GfapのgRNA target siteと同程度脱メチル化されている領域は見られなかった．つまり，非特異的なDNA脱メチル化はほとんど起こっていないことが明らかとなった．またRNA-seqによる発現解析を行い，発現の変化はほとんど見られなかった．
In vivoにおいてこのシステムが機能するかどうかは，将来的にエピゲノム治療などを目指した場合において非常に重要なことである．それを検討するためマウス胎仔脳にこの技術を適用した．上述のように胎生中期では神経前駆細胞においてGfapの転写調節領域は高度にDNAメチル化されているが，胎生後期ではDNA脱メチル化され，STAT3が結合できるようになることでGfapの発現が上昇し，アストロサイトに分化できるようになる．この領域がDNA脱メチル化されない神経前駆細胞はニューロンへと分化可能になる．胎生14日目でマウスの胎児を母体から取り出し，Gfapの転写調節領域をDNA脱メチル化するためのコンストラクトを脳室帯（ventricular zone）にエレクトロポレーションした．その後，母体に戻して1日後にGfapの転写調節領域は脱メチル化され，また4日後には，実際にGFAPタンパク質が上昇していることが明らかとなった．したがってin vivoにおいても，このシステムはDNA脱メチル化を誘導できることが明らかにした．
以上述べてきたように，私たちはゲノム編集の技術を応用し，dCas9とSunTagシステムを組み合わせることで，特定のDNAメチル化領域を極めて効率的に脱メチル化する系を開発した．さらにこのシステムはin vivoにおいても適用できることを示した．
ZFNやTALENなどのゲノム編集法の技術を応用したDNA脱メチル化編集の論文がいくつかすでに報告されている(10, 11)10) H. Chen, H. G. Kazemier, M. L. de Groote, M. H. Ruiters, G. L. Xu & M. G. Rots: Nucleic Acids Res., 42, 1563 (2014).11) M. L. Maeder, J. F. Angstman, M. E. Richardson, S. J. Linder, V. M. Cascio, S. Q. Tsai, Q. H. Ho, J. D. Sander, D. Reyon, B. E. Bernstein et al.: Nat. Biotechnol., 31, 1137 (2013).．しかしながら私たちの開発した系と比較してそのDNA脱メチル化効率はあまりよくない．またDNA脱メチル化できる範囲も30 bp程度と極めて狭い．その理由として2つのことが考えられる．一つは，Cas9はZFNやTALENと比較してDNAメチル化領域をターゲットとした場合，その領域に結合しやすいということが考えられる(12～14)12) P. D. Hsu, D. A. Scott, J. A. Weinstein, F. A. Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y. Li, E. J. Fine, X. Wu, O. Shalem et al.: Nat. Biotechnol., 31, 827 (2013).13) S. Bultmann, R. Morbitzer, C. S. Schmidt, K. Thanisch, F. Spada, J. Elsaesser, T. Lahaye & H. Leonhardt: Nucleic Acids Res., 40, 5368 (2012).14) S. Chen, G. Oikonomou, C. N. Chiu, B. J. Niles, J. Liu, D. A. Lee, I. Antoshechkin & D. A. Prober: Nucleic Acids Res., 41, 2769 (2013).．つまりDNAの修飾に影響されることなく，Cas9はターゲット領域に結合できるということである．2つめに，私たちのシステムは複数のTET1をターゲット領域に呼びこむことができるため，ターゲットを含んだ少なくとも200 bp以上の範囲で効率的にDNA脱メチル化が可能になると考えられる．
エピゲノム編集の応用はこれから発展していくであろう．まず基礎的研究において，今まで不可能であった特定領域のエピジェネティック修飾の機能解析が可能となる．今まではDNAメチル基転移酵素阻害剤やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などの薬剤により，非特異的にエピジェネティック修飾を変えることしかできなかった．エピゲノム編集により特定の遺伝子のみの発現制御が可能となるため，細胞分化やリプログラミングの研究において新たな遺伝子解析の手法となりうる．さらに，エピゲノム疾患モデル動物の作製が可能となる．また臨床応用においては，疾患の原因となる遺伝子の発現を安定して上昇させたり，あるいは抑制したりすることで，さまざまな疾患の遺伝子治療が可能となるであろう．またエピゲノム編集による治療はゲノムの変化が起きないため，より安全な治療であると考えられる．
Reference
1) M. H. Porteus & D. Carroll: Nat. Biotechnol., 23, 967 (2005).
6) P. I. Thakore, J. B. Black, I. B. Hilton & C. A. Gersbach: Nat. Methods, 13, 127 (2016).
9) M. E. Tanenbaum, L. A. Gilbert, L. S. Qi, J. S. Weissman & R. D. Vale: Cell, 159, 635 (2014).
生きた細胞内で機能するミニ抗体（single-chain antibody: scFv）とその抗体が認識するエピトープ（GCN4）からなる．