1. 人工制限酵素

標的変異は，人工制限酵素を用いて標的遺伝子にDNA二重鎖切断（DNA double strand breaks; DSBs）を誘導し，その修復過程で生じる誤り（ここでは，元の塩基配列と異なる配列に修復されることを指す）を利用して標的遺伝子に挿入や欠失などさまざまな変異を導入する技術である⁽¹⁾（図1図1■ゲノム編集の種類）．これまでに，人工制限酵素として，既存のメガヌクレアーゼを改変した改変型メガヌクレアーゼ，DNA結合ドメインとヌクレアーゼドメインを融合したZFNsやTALENs，元来は細菌の免疫システムであり，標的遺伝子を認識するRNA分子（guide RNA; gRNA）とDNA切断酵素（Cas9）の複合体であるCRISPR/Cas9などが報告されている⁽²⁾2) H. Puchta & F. Fauser: Plant J., 78, 727 (2014).が，人工制限酵素ベクターの構築の容易さ，および標的配列に対する切断活性の高さなどから，TALENsやCRISPR/Cas9が広く利用されている．一方，上記の人工制限酵素以外にも，PPRタンパク質⁽³⁾3) Y. Yagi, M. Shirakawa & T. Nakamura: Nature, (2015), Sponsor feature.やArgonauteタンパク質⁽⁴⁾4) B. Enghiad & H. Zhao: ACS Synth. Biol., 6, 752 (2017).を利用した人工制限酵素の開発が試みられており，今後の進展が期待される．

2. イネにおけるCRISPR/Cas9を用いた標的変異

イネでは，アグロバクテリウムを利用した遺伝子導入法が広く利用されている．すなわち，完熟種子や未熟胚由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させることで外来遺伝子を導入し，形質転換に成功した細胞塊を抗生物質などの薬剤を用いて選抜して，そこから植物体を再分化させる方法である．標的変異においても，このスキームに従い，カルスに人工制限酵素発現ベクターを形質転換し，変異が導入された細胞を含むカルス塊から植物体へ再生させる．人工制限酵素によって標的変異が生じるイベントと選抜マーカーの導入によって薬剤耐性が付与されるイベントは独立した事象であるため，標的変異に成功した細胞自身に薬剤耐性などの選抜形質が付与される実験系でない限り，形質転換に成功した細胞すべてに標的変異を導入できるわけではない^{(5, 6)}5) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Cell Physiol., 56, 41 (2015).6) A. Nishizawa-Yokoi, T. Cermak, T. Hoshino, K. Sugimoto, H. Saika, A. Mori, K. Osakabe, M. Hamada, Y. Katayose, C. Starker et al.: Plant Physiol., 170, 653 (2016).．よって，標的変異に成功した再分化個体を効率よく獲得するためには，より多くの標的変異細胞が含まれる形質転換カルス塊を作出する必要がある．標的遺伝子や標的配列によっても異なるが，当室で開発したイネに最適化したCRISPR/Cas9ベクターを用いれば，10系統程度の独立した形質転換カルスを準備することで，標的変異に成功した個体を問題なく得ることができ，また，形質転換当代の植物体で，標的遺伝子の両アリルに変異が導入された系統を得ることも可能である^{(5, 7, 8)}5) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Cell Physiol., 56, 41 (2015).7) M. Mikami, S. Toki & M. Endo: Plant Cell Rep., 34, 1807 (2015).8) M. Mikami, S. Toki & M. Endo: Plant Mol. Biol., 88, 561 (2015).．これまでに，標的遺伝子を破壊することにより，品質や収量，耐病性などの農業形質を改変したイネが多数作出されている．

CRISPR/Cas9はgRNAを簡便にデザインすることが可能であるため，非常に汎用性が高い人工制限酵素である．また，ほかの人工制限酵素とは異なり，複数のgRNAを同時に発現させることによって，複数の異なる標的配列を切断することが可能であるため，一度のゲノム編集実験により，複数の標的遺伝子を改変した個体を容易に作出することが可能である．複数のgRNAを同時に発現させる一番単純な方法は，複数のgRNA発現カセットをベクター上に用意することであるが，Golden Gate cloning法やGibson assembly法など，ベクター構築を容易にする方法が開発されている⁽⁹⁾9) X. L. Ma, Q. L. Zhu, Y. L. Chen & Y. G. Liu: Mol. Plant, 9, 961 (2016).．また，複数のgRNAを連結して発現させ，そのトリミングにtRNAのプロセシングシステムや自己切断機能をもつribozymeのシステムを応用し，一つの転写単位で複数のgRNAを生産できるようなベクター構築システムも開発されている⁽⁹⁾9) X. L. Ma, Q. L. Zhu, Y. L. Chen & Y. G. Liu: Mol. Plant, 9, 961 (2016).．一方，gRNAは100 nt程度の短いRNA分子であることから，通常，U6のようなRNAポリメラーゼIII型の転写調節を利用して発現させる．それに対し，gRNAとCas9を一つの転写単位として，RNAポリメラーゼII型のシステムを利用して発現させることで，イネの標的変異に成功したことが報告されている⁽¹⁰⁾10) X. Tang, X. L. Zheng, Y. P. Qi, D. W. Zhang, Y. Cheng, A. T. Tang, D. F. Voytas & Y. Zhang: Mol. Plant, 9, 1088 (2016).．この方法では，gRNAの発現にも組織特異性をもたせることが可能になる．

図1■ゲノム編集の種類

Cas9によるDNA切断には，Cas9タンパク質自体が標的配列近傍に存在するproto-spacer adjacent motif（PAM）配列を認識することが必要である．よって，PAM配列がCRISPR/Cas9による標的配列の自由度を制限する主要因となっている．PAM配列は細菌の種類によって異なることから，別の細菌に由来するCRISPR/Cas9を利用することで認識できる標的配列の幅を広げることが可能である．これまでに，イネにおいてゲノム配列を切断できることが報告されているCRISPRシステムを表1表1■イネで利用可能なCas9およびCpf1の比較に示した．特に，FnCpf1においては，SpCas9やSaCas9とは異なり，PAM配列にグアニンが含まれず，標的配列として利用できる選択肢が広くなっただけではなく，突出末端が形成されることからDNA断片をDSBs部位に挿入する頻度を上げることができると期待される．また，SpCas9においては，アミノ酸置換によりPAM配列が改変された変異型タンパク質の作出に成功しており，イネにおいても，従来とは異なるPAM配列（5′-NGA-3′，5′-NGCG-3′）を有する標的配列に変異を導入できることが報告されている⁽¹³⁾13) X. X. Hu, C. Wang, Y. P. Fu, Q. Liu, X. Z. Jiao & K. J. Wang: Mol. Plant, 9, 943 (2016).．このような研究が進むことによって，将来的にはPAM配列の制限を受けない変異型Cas9タンパク質を開発することができると期待される．

3. off-target変異

人工制限酵素のうち，特にCRISPR/Cas9は，標的遺伝子以外の相同性が高い配列を切断することがあり，標的遺伝子以外の配列に意図しない変異（off-target変異）が導入されることが報告されている．

Cas9タンパク質は，2つのDNA切断ドメインが二本鎖DNAのそれぞれの鎖を切断することによりDSBsを誘導する．Cas9のDNA切断ドメインのうち片方の活性を欠失させることで，一方の鎖のみを切断し，ニック（nick）を導入するnickaseとして機能させることが可能である．そこで，Cas9 nickaseと隣接する2カ所の異なる鎖の配列を認識するgRNAを設計することにより，DNA鎖の両側にニックを導入でき，結果的にDSBsを誘導することができる．この方法では，Cas9 nickaseが2カ所の塩基配列を認識することにより，標的部位の認識特異性を上げることができる．イネにおいても，Cas9 nickaseの利用によりoff-target変異を抑えることができると報告されている⁽¹⁴⁾14) M. Mikami, S. Toki & M. Endo: Plant Cell Physiol., 57, 1058 (2016).．一方，Cas9タンパク質の立体構造情報をもとに，DNA鎖との結合能力を改変した変異タンパク質を作出することで，ヒト細胞においてoff-target変異を抑制したことが報告されている^{(15, 16)}15) I. M. Slaymaker, L. Y. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. Yan & F. Zhang: Science, 351, 84 (2016).16) B. P. Kleinstiver, V. Pattanayak, M. S. Prew, S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, Z. Zheng & J. K. Joung: Nature, 529, 490 (2016).．現在のところ，この方法については，植物への適用例は報告されていない．

off-target変異は，人工制限酵素のDNA認識能の特異性が低い場合や，DNA認識能の特異性が高い適切な人工制限酵素でも大過剰量や長期間適用することにより生じることが報告されている．そのため，人工制限酵素を組織または時期特異的に機能させる方法も開発されている．たとえば，シロイヌナズナでは，組織特異的に人工制限酵素を働かせて標的変異個体を獲得した例が報告されている⁽⁹⁾9) X. L. Ma, Q. L. Zhu, Y. L. Chen & Y. G. Liu: Mol. Plant, 9, 961 (2016).が，イネではまだそのような報告はない．一方，off-target変異を逆に利用し，一つのgRNAを用いて複数の類似遺伝子を破壊することも可能であり，イネで相同性が高い3個の遺伝子を同時に破壊することに成功している⁽⁵⁾5) M. Endo, M. Mikami & S. Toki: Plant Cell Physiol., 56, 41 (2015).．

なお，特にイネのような自殖可能な植物においては，自殖や戻し交雑などにより，遺伝的背景を原系統に近づけることが可能である．また，一般的に，ヒトの遺伝子治療など標的遺伝子以外に変異が導入されることが許容されない場合と異なり，農作物の育種においては生育などの表現型に変化が生じていなければoff-target変異が許容される可能性が考えられる．

上述のとおり，イネにおいては自殖または交配が容易であるため，後代個体の中から標的遺伝子に変異が入っているが外来遺伝子を含まない個体（null segregant）を得ることができる．一方，複数の植物において，物理的導入法により人工制限酵素遺伝子のDNA, mRNAやタンパク質を細胞内に直接導入し，標的変異に成功した例が報告されている．たとえば，PEG法を用いてタバコのプロトプラストにTALENsのmRNAやタンパク質を直接導入することで，標的変異に成功したことが報告されている^{(17, 18)}17) S. Luo, J. Li, T. J. Stoddard, N. J. Baltes, Z. L. Demorest, B. M. Clasen, A. Coffman, A. Retterath, L. Mathis, D. F. Voytas et al.: Mol. Plant, 8, 1425 (2015).18) T. J. Stoddard, B. M. Clasen, N. J. Baltes, Z. L. Demorest, D. F. Voytas, F. Zhang & S. Luo: PLOS ONE, 11, e0154634 (2016).．また，イネ，コムギ，トウモロコシなどの複数の植物種において，PEG法やパーティクルボンバードメント法によりin vitroで形成したCas9タンパク質とgRNAとの複合体を細胞内に直接導入し，標的変異を誘導できることも報告されている^(19～21)．

プロトプラストを用いる方法では，個々の細胞を独立に扱うことが可能であるため，薬剤などによる形質転換細胞の選抜を経ずとも，標的変異に成功した細胞や個体を得ることが可能である．また，プロトプラストにDNAを導入する方法では，人工制限酵素遺伝子の一過的発現により，植物ゲノム中に外来遺伝子を挿入せずに標的変異を誘導することが可能である．さらに，人工制限酵素のmRNAやタンパク質を細胞に直接導入する方法では，導入に用いるmRNAやタンパク質の量を厳密に制御できるため，DNAを導入した場合と比較して短期間で効果的な量の人工制限酵素を機能させることが可能であり，off-target変異の抑制にも有効である．一方，イネのプロトプラスト形質転換法は培養期間が長く，熟練した操作が必要であることから，ソマクローナル変異の軽減と実験系の汎用化が課題である．

標的変異によって導入される変異は，DSBsの修復過程において生じる誤りの結果である．DSBsの修復経路は複数存在し，細胞が由来する組織や細胞周期，生じた損傷の種類によって，DSBsの修復経路が異なる．現時点では，DSBs修復の選択を人的に操作する実験系はなく，標的遺伝子に導入される変異のパターンも予測できないが，一般的には，人工制限酵素を用いてDSBsを導入した場合，欠失や挿入は生じやすいが，塩基置換は生じにくい．特にCRISPR/Cas9による標的変異では，1～数塩基程度の欠失や挿入が高頻度で生じる．したがって，標的変異では標的遺伝子を破壊することがほとんどであり，アミノ酸置換などによりタンパク質機能が改変されることはまれである．植物の体細胞において，DSBsの修復機構のうち最も主導的に機能するのは，切断されたDNA末端をそのまま結合する非相同末端結合経路（NHEJ）である．たとえば，この経路の最終酵素であり，切断末端を結合する機能を有するDNA Ligase4が欠損したイネ変異体では，野生型と比較してTALENsによる標的変異頻度が向上し，導入される欠失長が長くなることが報告されている⁽⁶⁾6) A. Nishizawa-Yokoi, T. Cermak, T. Hoshino, K. Sugimoto, H. Saika, A. Mori, K. Osakabe, M. Hamada, Y. Katayose, C. Starker et al.: Plant Physiol., 170, 653 (2016).．また，標的遺伝子に数塩基以上の欠失が生じていた場合，欠失配列の両端に数塩基程度の短い相同配列（マイクロホモロジー）が存在していることが多く，欠失にはマイクロホモロジー介在末端結合経路が関与していることが示唆されている⁽⁶⁾6) A. Nishizawa-Yokoi, T. Cermak, T. Hoshino, K. Sugimoto, H. Saika, A. Mori, K. Osakabe, M. Hamada, Y. Katayose, C. Starker et al.: Plant Physiol., 170, 653 (2016).．したがって，このような経路を抑制または活性化することで導入される変異のスペクトラムを改変できるかもしれない．一方，人工制限酵素によって隣接する2カ所にDSBsを誘導することにより，その間を欠失させることが可能である．代謝系の酵素遺伝子には遺伝子クラスターを形成しているものもあり，2カ所を切断することによりそのようなクラスターを一度に欠失させることが可能である．これまでに，イネにおいて，245 kbもの長鎖配列を欠失させることに成功したことが報告されている⁽²²⁾22) H. Zhou, B. Liu, D. P. Weeks, M. H. Spalding & B. Yang: Nucleic Acids Res., 42, 10903 (2014).．

一方，イネにおいて，Cas9 nickaseとDNA修復経路の一つである塩基除去修復経路の酵素シトシンデアミナーゼを融合した人工酵素を用いることにより，標的配列のシトシンをチミンに変換し，目的の塩基置換を誘導することに成功したことが複数のグループから報告された^(23～2523) J. Li, Y. Sun, J. Du, Y. Zhao & L. Xia: Mol. Plant, 10, 526 (2017).24) Y. Lu & J. K. Zhu: Mol. Plant, 10, 523 (2017).25) Z. Shimatani, S. Kashojiya, M. Takayama, R. Terada, T. Arazoe, H. Ishii, H. Teramura, T. Yamamoto, H. Komatsu, K. Miura et al.: Nat. Biotechnol., 35, 441 (2017).⁾．現在のところ，この方法は標的変異によって積極的に塩基置換を誘導する唯一の方法であるが，シトシンのみを改変することから，ほかの塩基を改変する技術開発が望まれる．

1. GTとは

GT技術は，標的遺伝子を含む配列と相同な鋳型DNAを利用し，標的遺伝子と鋳型DNA間の相同組換え（homologous recombination; HR）により，鋳型DNAが有する変異を標的遺伝子にコピーする技術である（図1図1■ゲノム編集の種類）．この技術では鋳型DNA上の変異がそのままコピーされるため，標的変異とは異なり，目的どおりに標的遺伝子を改変することが可能である．イネのGTは日本が初めて成功例を報告しており⁽²⁶⁾26) R. Terada, H. Urawa, Y. Inagaki, K. Tsugane & S. Iida: Nat. Biotechnol., 20, 1030 (2002).，現在も世界を大きくリードしている．筆者らは，これまでにGTによって除草剤耐性イネ⁽²⁷⁾27) M. Endo, K. Osakabe, K. Ono, H. Handa, T. Shimizu & S. Toki: Plant J., 52, 157 (2007).やアミノ酸高蓄積イネ⁽²⁸⁾28) H. Saika, A. Oikawa, F. Matsuda, H. Onodera, K. Saito & S. Toki: Plant Physiol., 156, 1269 (2011).などの育種素材となりうる系統を作出することに成功している．一方，イネ以外の顕花植物においては，GTによって内在性遺伝子を改変した報告は少なく，イネが最も進んでいると言える．

2. GT細胞の選抜法

GTは，その選抜法により，標的遺伝子特異的選抜法とポジティブ・ネガティブ選抜法の2種類に大別される．前者はGTによって標的遺伝子に目的の変異を導入することで，改変された標的遺伝子自身が選抜マーカーになりうる場合に利用できる．たとえば，除草剤の標的遺伝子に対して，GTによって除草剤耐性型の変異を導入することで，除草剤耐性形質を指標にGTに成功した細胞を直接獲得することが可能である⁽²⁷⁾27) M. Endo, K. Osakabe, K. Ono, H. Handa, T. Shimizu & S. Toki: Plant J., 52, 157 (2007).．しかしながら，この方法は，選抜マーカーとなりうる遺伝子と変異の組み合わせでなければ使用することはできない．それに対し，後者は，形質転換に成功した細胞に薬剤耐性などを付与するポジティブ選抜マーカー遺伝子と，鋳型DNAがゲノムの目的外の部位に挿入された細胞の生育を抑制するネガティブ選抜マーカーの2種類を利用する方法であり，原理的にはあらゆる遺伝子に適用可能である（図2図2■ポジティブ・ネガティブ選抜法を用いたGTのスキーム）．ポジティブ・ネガティブ選抜法によるGTの場合，ポジティブ選抜マーカー遺伝子は標的遺伝子内部またはその近傍に挿入されるが，同時に相同配列上の変異も標的遺伝子に導入することが可能である．そこで，ポジティブ・ネガティブ選抜法によるGTとポジティブ選抜マーカーの除去を組み合わせることで，標的遺伝子に必要最小限の変異だけを導入することが可能である（図3図3■GTとマーカー除去を利用した変異導入スキーム）．これまでに，イネにおいては，バクテリオファージのCre/loxを用いたシステム⁽²⁹⁾29) R. Terada, M. Nagahara, K. Furukawa, M. Shimamoto, K. Yamaguchi & S. Iida: Plant Biotechnol., 27, 29 (2010).，昆虫のトランスポゾンpiggyBac ⁽³⁰⁾30) A. Nishizawa-Yokoi, M. Endo, N. Ohtsuki, H. Saika & S. Toki: Plant J., 81, 160 (2015).やDSBs修復の一つである単鎖アニーリング（SSA）を利用したシステム⁽³¹⁾31) 雑賀啓明：JATAFFジャーナル4, 59 (2016).などが利用されている．Cre/loxは，さまざまな生物で広く使用されているマーカー除去システムであり，部位特異的組換え酵素Creが30 bp程度のloxP配列を認識して，タンデムに重複したloxP配列の内部を離脱させる．この方法では，loxP配列が宿主ゲノム中に残存することから，loxP配列をイントロンや遺伝子間領域にもたせるなどの工夫が必要となる．一方，piggyBacトランスポゾンにおいて，transposaseであるPBaseは，トランスポゾン特異的逆位末端配列に囲まれた配列を，宿主ゲノムに存在する「TTA A」の塩基配列に挿入，離脱させる．よって，ポジティブ選抜マーカーの両側にトランスポゾン特異的逆位末端配列を配置しておき，宿主ゲノム中の「TTA A」配列にポジティブ選抜マーカーを挿入することにより，PBaseを用いて余分な変異を残さずにマーカーを除去することが可能である．また，SSAを利用した方法では，ポジティブ選抜マーカーの両側にタンデム重複配列と制限酵素の認識配列を配置する．GT後に制限酵素によりDSBsを誘導し，生じた単鎖の重複配列がアニーリングすることにより，重複配列内部を脱離させることができ，piggyBacと同様に余分な変異を残さずにマーカーを除去することが可能である．この方法は，原理的にはどのような配列でも応用可能であり，piggyBacより汎用性が高い方法であるが，DSBs部位でSSAを効率よく誘導する技術は確立されていないため，その効率はpiggyBacに劣る．以上のように，標的遺伝子特異的選抜法はSDN-2型の変異，ポジティブ・ネガティブ選抜法はSDN-2型，または3型の変異を導入することが可能である（図1図1■ゲノム編集の種類）．

図2■ポジティブ・ネガティブ選抜法を用いたGTのスキーム

図3■GTとマーカー除去を利用した変異導入スキーム

3. GTの高効率化

一般的に，高等植物においては，GTの効率は標的変異に比べてはるかに低く，通常の遺伝子導入の10⁻³～10⁻⁶の頻度でしか生じないことが報告されている⁽³²⁾32) S. Iida & R. Terada: Curr. Opin. Biotechnol., 15, 132 (2004).．GTの効率は，①標的遺伝子の鋳型となる外来DNAの効果的な供給，②外来DNAと標的遺伝子との効率的なHR，③GTに成功した細胞を取りこぼさずに選抜することの大きく3つの要因によって決定され⁽³³⁾33) H. Saika & S. Toki: Jpn. Agric. Res. Q., 43, 81 (2009).，それぞれの要因からGT効率を改善する研究が取り組まれている．なお，イネにおいては，高効率かつ汎用的な遺伝子導入システムや形質転換細胞の選抜システムが開発されてきたため，一定の労力は必要となるが，大量の形質転換細胞（およそ10 g程度のカルス）を準備すればGT細胞を得ることは十分可能である．また，イネカルスは培養中に盛んに細胞分裂を繰り返しているため，DSBsが生じやすい条件にあると考えてられている．これらのことから，イネはほかの植物に比べて，GTが生じやすく，かつGT細胞をロスせずに獲得できるような条件の最適化がなされてきた数少ない植物種であるといえる．