本研究の目的，方法および結果

【目的】

酢は，塩と並んで人類最古の調味料とされ，日本では3世紀には米酢が生産されていた記録がある⁽¹⁾1) 酢酸菌研究会（外内尚人代表編）：“食物と健康の科学シリーズ　酢の機能と科学”，朝倉書店，2012.．造酢技術の一つである伝統的静置発酵は江戸時代後期に確立され，現在まで続いている．近年普及した，純化された発酵菌を原料に投入して短期間に発酵を終了する深部発酵法とは大きく異なり，静置発酵は開放的な環境で長期間静置されているにもかかわらず，安定した酢づくりが可能である．本研究の目的は，静置発酵による生産を続ける酢蔵が，創業以来大切に植え継いできた菌を同定することと，発酵液から菌を単離し，純粋培養した際の発酵液の成分変化を追跡することで，それぞれの菌の働きを明らかにすることである．

【方法】

（1） 2015年10月4日に，静置発酵で酢をつくる（株）中橋造酢（香川県三豊市，創業276年）を訪問した．酢酸発酵中の杉樽（発酵3週目の前期・7週目の後期）の液面から20 cm下から酢酸発酵液を20 mL，加えて発酵液表面の菌膜を2 mL採取した（図1図1■伝統的静置発酵で酢が作られている蔵）．また，後期酢酸発酵液を持ち帰り，その一部を松下の報告⁽²⁾2) 松下一信：好気呼吸による「発酵」を行う酢酸菌，生物工学，90, 340 (2012).を参考に作ったエタノール培地とポテト培地で培養した．次に，これら試料から増幅した16S rDNAを，DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）によって種ごとに分離した．分離したバンドを含むゲルを切り出し，それぞれのDNAを増幅した後，塩基配列を解読し，データベースで検索・同定した．発酵液中の菌の経時変化は，バンドの太さ（＝鋳型DNA量）で判断した．

図1■伝統的静置発酵で酢が作られている蔵

杉樽の中に，日本酒と種酢を入れ，さらに発酵中期～後期の樽から酢酸菌膜が移植され，約3カ月の酢酸発酵が行われる．

（2） 2016年8月2日に，（株）中橋造酢から新たに発酵液を持ち帰り，酢蔵の発酵液を参考にした再現液体培地（市販の日本酒30％＋市販の醸造酢10％＋水60％）に植え継いだ．この再現液体培地を，再現液体培地に寒天を加えた再現寒天培地，グルコース・グルコン酸培地，乳酸菌用MRS＋トマトジュース培地に画線し，それらを好気的・嫌気的条件下におくことでコロニーを単離した．単離できた菌株は再現液体培地で純粋培養し，その培養液のエタノール量をアルコール脱水素酵素による酵素法で，グルコース量をグルコースキットで，酸度を水酸化ナトリウムによる中和滴定で，0, 2, 4, 6, 10日後にそれぞれ測定した．各培養は，37°Cに維持した恒温器で行った．

【結果】

（1） DGGEの結果，試料には酢酸菌5種，酢酸菌以外が3種いたことを確認した（図2図2■16S rDNAのDGGE解析の結果）．発酵初期に比べると，Saccharibacillus kuerlensis, Paenibacillus sp., 乳酸菌のLactobacillus acetotoleransが発酵後期からは減少し，Acetobacter pasteurianusが増えていた（図2図2■16S rDNAのDGGE解析の結果）．