抗真菌抗生物質の探索とレプトマイシンの発見

深在性真菌症は免疫力の低下した患者に起こる日和見感染であり，近年，キャンディン系やアゾール系の優れた抗真菌剤が開発されるまでは難治の感染症であった．郡司，別府らは形態変化を指標に細胞壁合成を標的とする抗真菌抗生物質のスクリーニングに取り組んだ結果，ケカビや分裂酵母など一部の真菌にのみ特異的な増殖阻害と形態変化を誘導する物質としてレプトマイシン（LM）AおよびB（図1図1■レプトマイシンの化学構造）を単離した⁽¹⁾1) S. Gunji, K. Arima & T. Beppu: Agric. Biol. Chem., 47, 2061 (1983).．構造は末端にδ-ラクトン環を有する不飽和脂肪酸であり，特に分裂酵母に20 ng/mLという低濃度で増殖停止とともに形態伸長を引き起こすという特徴を示した^{(2, 3)}2) T. Hamamoto, S. Gunji, H. Tsuji & T. Beppu: J. Antibiot., 36, 639 (1983).3) T. Hamamoto, H. Seto & T. Beppu: J. Antibiot., 36, 646 (1983).．また，動物細胞にもnMオーダーの低濃度で細胞周期のG1期停止を誘導するとともに抗腫瘍活性を示す^{(4, 5)}4) K. Komiyama, K. Okada, S. Tomisaka, I. Umezawa, T. Hamamoto & T. Beppu: J. Antibiot., 38, 427 (1985).5) M. Yoshida, M. Nishikawa, K. Nishi, K. Abe, S. Horinouchi & T. Beppu: Exp. Cell Res., 187, 150 (1990).．構造活性相関から，末端の不飽和のδ-ラクトン環は活性に必要であるが，一方の末端にあるカルボン酸は不要であることが示唆された．実際，カルボン酸に種々の化学修飾をしても活性は維持されるが，飽和のラクトンに変換すると活性が完全に失われる．LMの発見の後，カズサマイシン，アンギノマイシン，レプトールスタチンなどいくつかの構造類縁体がいずれも強い抗腫瘍活性物質として報告されている^(6～9)6) I. Umezawa, K. Komiyama, H. Oka, K. Okada, S. Tomisaka, T. Miyano & S. Takano: J. Antibiot., 37, 706 (1984).7) K. Komiyama, K. Okada, Y. Hirokawa, K. Masuda, S. Tomisaka & I. Umezawa: J. Antibiot., 38, 224 (1985).8) K. Komiyama, K. Okada, H. Oka, K. Tomisaka, T. Miyano, S. Funayama & I. Umezawa: J. Antibiot., 38, 220 (1985).9) K. Komiyama, K. Okada, K. Tomisaka, I. Umizawa, T. Hamamoto & T. Beppu: J. Antibiot., 38, 427 (1985).．

図1■レプトマイシンの化学構造

LMBの標的分子：CRM1の同定

LMの作用機構については主成分であるLMBを用い，遺伝学的解析が可能な分裂酵母を利用して行われた．われわれはLMB耐性の分裂酵母変異株を取得し，変異株のゲノムライブラリーから野生株分裂酵母にLMB耐性を与える耐性遺伝子をクローン化した⁽¹⁰⁾10) K. Nishi, M. Yoshida, D. Fujiwara, M. Nishikawa, S. Horinouchi & T. Beppu: J. Biol. Chem., 269, 6320 (1994).．得られた耐性遺伝子は，以前に柳田らにより同定された染色体高次構造維持に関連する必須遺伝子crm1の変異遺伝子であり，野生株に導入するとLMB選択的な耐性を示した．その温度感受性変異株の核形態異常やタンパク質発現などの表現型は，すべてLMBを分裂酵母野生株に作用させときの表現型と同一だったことから，LMBの標的分子はCRM1そのものであると結論した⁽¹⁰⁾10) K. Nishi, M. Yoshida, D. Fujiwara, M. Nishikawa, S. Horinouchi & T. Beppu: J. Biol. Chem., 269, 6320 (1994).．しかし，その時点ではCRM1タンパク質には，機能を推定できるような既知ドメインが認められず，その真の機能は不明であった．CRM1は種を超えてよく保存されていたことから，CRM1こそが真菌からヒトまで共通のLMの標的分子と考えられた．そこで，われわれは，ヒトCRM1の単離を行ったところ，得られたヒトCRM1ホモログは全長にわたって50％以上の相同性を示し，分裂酵母のcrm1変異株を相補することができた⁽¹¹⁾11) N. Kudo, S. Khochbin, K. Nishi, K. Kitano, M. Yanagida, M. Yoshida & S. Horinouchi: J. Biol. Chem., 272, 29742 (1997).．ヒトCRM1は核膜に局在し，核および核膜機能に関連すると考えられた．

LMBの標的タンパク質CRM1は核外移行シグナルの受容体である

同じ頃，WolffらはエイズウィルスRevタンパク質の核外移行阻害剤としてのLMBを再発見した⁽¹²⁾12) B. Wolff, J. J. Sanglier & Y. Wang: Chem. Biol., 4, 139 (1997).．この新たな生物活性の発見をきっかけとして，CRM1の分子機能は急展開で明らかになった．タンパク質の核移行には，核移行シグナル（NLS）が必要である．NLSを介した核移行のメカニズムは古くからよく研究されていたが，核外移行については，1995年に初めて核外移行シグナル（NES）の存在が報告されていたものの，その受容体も含めて輸送の分子機構は不明であった．NESはロイシンに富んだ10アミノ酸程度の短い配列であり，GFPなど蛍光タンパク質に付加すると，局在が細胞質に大きく傾く．HIVのRevは初めて発見されたNES含有タンパク質の一つであり，Revは宿主の核外移行装置を利用してウイルス複製に必要となるウイルスRNAの核外輸送を行っていると考えられた．LMBがRevの核外移行機構を阻害するというWolffらの発見は，CRM1が真核生物に共通のタンパク質核外移行に重要な機能を果たしていることを示唆する．そこで，NESを付加したマーカータンパク質を発現した細胞にLMBを添加すると，速やかに核局在が回復した．結局，われわれを含めいくつかのグループによってCRM1の機能欠損により核外移行が阻害されること，CRM1はRanGTP依存的にNESと直接結合することが示され，CRM1はNESの受容体そのものであることが明らかになった^(13～16)13) M. Fornerod, M. Ohno, M. Yoshida & I. W. Mattaj: Cell, 90, 1051 (1997).14) M. Fukuda, S. Asano, T. Nakamura, M. Adachi, M. Yoshida, M. Yanagida & E. Nishida: Nature, 390, 308 (1997).15) B. Ossareh-Nazari, F. Bachelerie & C. W. Dargemont: Science, 278, 141 (1997).16) K. Stade, C. S. Ford, C. Guthrie & K. Weis: Cell, 90, 1041 (1997).（図2図2■核−細胞質間のタンパク質輸送）．CRM1はNLSの受容体であるimportinとの対比からexportin 1（XPO1）とも呼ばれるようになった．

図2■核−細胞質間のタンパク質輸送

NLSとNESを介した核−細胞質間のタンパク質輸送は，それぞれimportin複合体とexportin（CRM1）によって担われる．どちらも核内ではRanGTPと結合するが，importin βではRanGTPのないときに積荷と結合し，RanGTPと結合すると積荷と解離する．逆に，exportinであるCRM1ではRanGTPが存在するときに積荷と結合する．Importin βとexportinはどちらも自由に核膜孔を通過できるが，RanGTPの有無によって積荷の輸送方向が決定される．

レプトマイシンによるCRM1阻害の分子機構

LMBによるCRM1阻害機構の詳細は，分裂酵母の分子遺伝学とビオチン化したLMBを化学プローブとして用いる化学遺伝学的実験の組合せによって解明された．まず，LMB超感受性を示す分裂酵母の低温感受性crm1変異株の抑圧変異を単離したところ，LMB感受性を完全に失った変異株を見いだした．その変異を解析したところ，crm1遺伝子のCys-529（ヒトCRM1ではCys-528）がSerへ置換された変異であることがわかった⁽¹⁷⁾17) N. Kudo, N. Matsumori, H. Taoka, D. Fujiwara, E. P. Schreiner, B. Wolff, M. Yoshida & S. Horinouchi: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9112 (1999).．この変異体は野生型CRM1と異なり，LMBとの結合性を完全に失っていた．さらに興味深いことに，このLMB結合に関与するシステイン残基は分裂酵母だけでなくヒト，マウス，アフリカツメガエルなどLMBに感受性のある生物のCRM1では保存されており，LMBが全く作用しない出芽酵母やコウジカビではスレオニンであった．このことはたった1つのアミノ酸によってLMB感受性が決まっていることを示す（図3図3■レプトマイシンとの結合部位）．実際，Rosbash（2017年にノーベル賞受賞）らは出芽酵母のスレオニン残基をシステイン残基に置換することにより，LMB感受性の出芽酵母の作製に成功している⁽¹⁸⁾18) M. Neville & M. Rosbash: EMBO J., 18, 3746 (1999).．次にビオチン化したLMBを用いてLMBとCRM1がどのように結合するのかを調べたところ，LMBはα, β不飽和ラクトン部分のマイケル付加反応によりCRM1の保存されたシステイン残基と共有結合することが明らかになった（図4A図4■CRM1阻害剤の結合様式）．さらに，ビオチン化LMBを細胞の外から加え，細胞内でLMBと結合したタンパク質をストレプトアビジンにて単離すると，CRM1がLMBと細胞内で共有結合している唯一のタンパク質であることがわかった．マイケル付加反応は，一般的に特異性の低い反応であるが，LMBとCRM1の1カ所のシステイン残基との結合は極めて選択的である．その特異的結合においてLMBの長い疎水的な脂肪族部分が重要であることがわかっている．

図3■レプトマイシンとの結合部位

CRM1の中央領域は高度に保存されており，レプトマイシンとの結合に必須であるシステイン残基は，レプトマイシン感受性生物では保存されている．

図4■CRM1阻害剤の結合様式

A. NES結合領域に存在するシステイン残基とレプトマイシンはマイケル付加反応で結合する．さらにラクトン環が加水分解を受けることで安定に結合すると考えられる．B. KPT-330は同様に，マイケル付加反応によってシステインと共有結合するが，加水分解は受けないため，可逆的な結合となる．

CRM1の構造と機能

核膜で仕切られた核と細胞質の間での物質輸送が，シグナル伝達や細胞周期の制御に重要であることはよく知られている．核膜では核膜孔を介して物質輸送が行われ，分子量4万以下の比較的小さなタンパク質は，エネルギー非依存的に拡散して核膜孔を通過することができる．一方，それ以上の高分子の輸送，または低分子タンパク質であっても自然拡散に抵抗して細胞内局在するためには核膜孔通過のための受容体とエネルギーが必要である．塩基性アミノ酸に富んだNLSの受容体としてimportin αとβがよく知られている．NLSはimportin αと結合するが，importin αのみでは核膜孔を通過する能力はなく，importin αがimportin βと複合体を形成することで初めて核内へ移動することができる．importin βは核膜孔タンパク質群と相互作用し，自分自身で核膜孔を通過する能力があるが，GTP結合型のRanと結合すると構造変化を起こし，複合体が解離すると考えられている．RanはRasと似たGTPaseであり，核内にはそのGTP/GDP交換因子であるRCC1が，一方，細胞質にはGAPであるRanBP1が局在するため，核内はGTP結合型，細胞質ではGDP結合型になっている．したがって，核内に移行したNLSとimportin α・β複合体にRanGTPが結合すると，3者複合体は解離し，積荷（cargo）としてのNLS含有タンパク質は核に残され，解離したimportin αおよびβは細胞質へリサイクルされると考えられている．自ら核膜孔を通過できるimportin βと異なり，importin αはCASと呼ばれる核外輸送因子の働きによって細胞質へ戻っていく．

NESの受容体であるCRM1は単独で核膜孔複合体と結合して実際に核膜孔を通過する能力をもつとともにNESと結合する能力も有する．そのN末端領域にはCASなどほかのexportinを含めimportin βファミリーに相同性のある領域（CRIME）があり，Ranとの結合に関与する．CRM1とNESとの結合は2者だけでは非常に弱く，RanGTPの結合に依存して安定な結合になる．ちょうどimportinの場合とは逆にNESとRanGTPとの3者複合体は，核膜を通過した後，細胞質のRanGAPの活性によりRanがGDP型になることによってcargoであるNES含有タンパク質が解離すると考えられる（図2図2■核−細胞質間のタンパク質輸送）．LMBが結合するシステイン残基が存在するCRM1の中央領域は，ヒトと酵母で高度に保存されており，極めて重要な機能を担う領域であることが推定された．しかし，CRM1の構造と機能の関係は長い間未解明となっていた．

2004年にCRM1の1/3に相当するC末端側の部分構造が解明され，CRM1がHEATリピートと呼ばれるヘリックス構造がつながったものであることが明らかになった⁽¹⁹⁾19) C. Petosa, G. Schoehn, P. Askjaer, U. Bauer, M. Moulin, U. Steuerwald, M. Soler-López, F. Baudin, I. W. Mattaj & C. W. Müller: Mol. Cell, 16, 761 (2004).．そしてCRM1がNES受容体であることが示されてから10年以上経過した2009年，ついにCRM1の全体の結晶構造解析が報告された⁽²⁰⁾20) T. Monecke, T. Güttler, P. Neumann, A. Dickmanns, D. Görlich & R. Ficner: Science, 324, 1087 (2009).．CRM1の立体構造は21個のHEATリピートからなる環状（トロイド）構造であり，N末端とC末端の間で開環したリングのように見える．NESを有するSnurportin1（SPN1）とRanGTPとの3者複合体の結晶構造から，CRM1はN末端領域のCRIMEドメインでRanGTPと結合すると，RanGTPを抱え込むように閉環構造となるため，NES結合部位が開き，NESと安定に結合できるようになる（図5図5■CRM1のX線結晶構造解析）．一方，細胞質でRanGTPがCRM1から解離すると，CRM1リング構造が変化することによりNES結合部位は閉じた構造となり，積荷はNES結合部位から解離して追い出される．このNES結合部位は，まさにLMBが結合するシステイン残基を含んだ疎水的な溝であった．2013年にはLMBとの共結晶も解明され，LMBはNES結合部位にぴったりとはまり，システイン残基と共有結合することが証明された⁽²¹⁾21) Q. Sun, Y. P. Carrasco, Y. Hu, X. Guo, H. Mirzaei, J. Macmillan & Y. M. Chook: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 1303 (2013).（図5図5■CRM1のX線結晶構造解析）．この際，ラクトン環はCRM1の作用により開環していることも明らかになった．その結果，周辺の塩基性残基との相互作用が高まることでLMBとの結合は安定化し，不可逆的にCRM1に結合すると考えられる（図4A図4■CRM1阻害剤の結合様式）．すなわち，LMBの結合部位はまさにNESの結合部位そのものであり，LMBが強固に結合することにより，CRM1はNESが結合できない不活性型になると結論された．

図5■CRM1のX線結晶構造解析

A. CRM1単独の結晶構造．CRM1単独の構造ではNES結合部位が閉じている．B. CRM1–RanGTP–NES複合体の結晶構造．RanGTPと結合した時の構造は，NES結合領域が開いている．C. NES結合部位の拡大図．D. レプトマイシンBと結合したNES結合部位の拡大図．

CRM1とがん

細胞をLMBで処理すると，核−細胞質間をシャトルするタンパク質の局在バランスが崩れるため，CRM1/XPO1依存的な核外輸送を受けるタンパク質の局在は，LMBによって大きく変化する．こうした観察により，多くのがん抑制因子をはじめ，核内の遺伝子発現調節にかかわる因子がCRM1/XPO1の積荷となっていることが判明した．すなわち，CRM1/XPO1によって核外輸送されるタンパク質としてp53, pRB, BRCA1, APCなどのがん抑制因子，p21, p27，サイクリン，CDC25などの細胞周期制御因子などが同定された．これらの因子は細胞質と核内をシャトルするものであり，LMB処理によって核内蓄積することが細胞周期停止や抗がん活性の原因となっていると考えられる．たとえば，LMBは非常に低い濃度で正常線維芽細胞の増殖を細胞周期のG1期で停止させるが，その原因としてタンパク質脱リン酸化酵素であるPP2Aの核内蓄積がかかわることが明らかになった．PP2AはNESをもち，LMB処理によってPP2Aが核内蓄積する結果，転写因子AP-1の主要構成因子であるc-Junの脱リン酸化が起き，G1期進行に必要なサイクリンD1のプロモーター活性が抑制される．すなわち，PP2Aの核移行によるサイクリンD1の遺伝子発現阻害がLMBによるG1期停止のメカニズムであることが明らかになった⁽²²⁾22) A. Tsuchiya, E. Tashiro, M. Yoshida & M. Imoto: Oncogene, 26, 1522 (2007).．

近年，多くのがん細胞でCRM1の高発現や突然変異などの異常が観察され，がんとCRM1の関係がますます注目されている．p53, pRB, BRCA1はいずれも核内で機能するがん抑制因子でありCRM1はこれらを核外へ輸送することでそれらのがん抑制機能を負に制御する．一方，アポトーシス阻害活性をもつタンパク質Survivinは，CRM1によって細胞質に蓄積することで効率よくカスパーゼの活性化を抑制し，がん細胞をアポトーシスから保護してその生存を支える．さらに最近，われわれはCortactinというタンパク質の局在制御を介して，がん細胞の転移や浸潤にかかわる運動性の獲得にもCRM1がかかわることを示した⁽²³⁾23) A. Ito, T. Shimazu, S. Maeda, A. A. Shah, T. Tsunoda, S. Iemura, T. Natsume, T. Suzuki, H. Motohashi, M. Yamamoto et al.: Sci. Signal., 8, ra120 (2015).．Cortactinはがん細胞で高発現することが知られるアクチン結合タンパク質である．Cortactinは増殖シグナルに応答して細胞質から細胞辺縁部へ移行して枝分かれしたアクチンフィラメントからなるラムリポディア（葉状仮足）を動的に形成して細胞の運動性を高める．Cortactinの細胞質局在と増殖刺激に応答した辺縁部への移行には，Keap1と呼ばれるタンパク質が必須であった．Keap1は酸化ストレスに応答するための転写因子NRF2の抑制因子として有名であるが，それとは独立にCortactinの細胞辺縁部局在を担う機能もあった．同時にCortactinとKeap1の結合は，Cortactinがアセチル化されると失われることも明らかになった．すなわち，Cortactinは核内にあるアセチル化酵素CBPによってアセチル化されて機能が抑制されるが，CRM1はCortactinを効率よく核外輸送することによってアセチル化を防ぐ働きがあると考えられる．このように，CRM1の高発現は，がん細胞の増殖と運動性を促進し，アポトーシスを抑制してがん細胞を生存させることにより，がんの発生や進展に関与すると考えられる．

CRM1を標的とした創薬

レプトマイシンやカズサマイシンなどの天然由来核外輸送阻害剤は，動物モデルで強い抗がん活性が認められたことから，抗がん剤として開発しようという研究が行われたが，物性や副作用などの問題で医薬品としての実用化には至らなかった．ところが最近，Karyopharm Therapeutics社により，SINE（Selective Inhibitors of Nuclear Export）と名付けられた一連の非天然の合成CRM1/XPO1阻害剤が開発され，種々の骨髄腫やウイルス性疾患への適用が検討されている．中でも経口投与可能なKPT-330（Selinexor）は米国において難治性骨髄腫と多発性骨髄腫の治療薬としての臨床試験が行われており，大きな期待が寄せられている．アジアでは小野薬品工業（株）が使用権を得て臨床試験を開始する予定となっている⁽²⁴⁾24) 米国カリオファーム社とXPO1阻害剤「Selinexor」および第二世代XPO1阻害剤「KPT-8602」に関するライセンス契約を締結https://www.ono.co.jp/jpnw/PDF/n17_1012.pdf．レプトマイシンBと同様，SINEもCRM1/XPO1の保存されたシステイン残基に共有結合することで核外輸送機能を阻害する．その結合様式は，X線共結晶構造解析により解明されたが⁽²¹⁾21) Q. Sun, Y. P. Carrasco, Y. Hu, X. Guo, H. Mirzaei, J. Macmillan & Y. M. Chook: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 1303 (2013).，ラクトン環が開環して安定で不可逆的に結合するLMBと異なり，SINEの結合は可逆的であった（図4B図4■CRM1阻害剤の結合様式）．このことがLMBに比べて毒性が低い理由かもしれない．最近では，多くのがんで見られる変異型KRASとCRM1/XPO1の阻害が合成致死の関係にあることが示され，核外輸送阻害剤がより多くのがんで有効である可能性が示唆されている⁽²⁵⁾25) J. Kim, E. McMillan, H. S. Kim, N. Venkateswaran, G. Makkar, J. Rodriguez-Canales, P. Villalobos, J. E. Neggers, S. Mendiratta, S. Wei et al.: Nature, 538, 114 (2016).．

おわりに

抗真菌抗生物質としてのレプトマイシンの発見から生命の根幹にかかわるメカニズムの解明と抗がん剤開発へと発展した歴史を振り返ると，微生物を用いたスクリーニング研究の重要性が改めて認識させられる．微生物由来の二次代謝産物は，医薬品の資源としての重要性だけでなく，新たな創薬標的の発見のための基礎研究ツールとしても重要であることを示している．近年，低分子からの創薬はだんだん難しくなっていると言われている．その大きな理由は，創薬標的の枯渇である．ゲノム研究からたくさんの新規創薬標的が見いだされると期待されたが，現実はさほど簡単ではなかった．カビや酵母といったヒトの慢性疾患のモデルになるとは思われない下等真核生物への作用を通じて，新しい創薬標的が解明されたことは教訓的であるとも言える．多くの企業で天然物創薬が下火になってしまった今，新たな創薬標的を見いだすための基礎研究として微生物スクリーニングを捉え直す時期にきたように思われる．